הכנת תרחיף חד-תאי ממעי אמנון הנילוס לריצוף חד-תאי

Summary

כאן, אנו מדגימים את הכנת תרחיף חד תאי באיכות גבוהה של מעי אמנון לריצוף תא בודד.

Abstract

אמנון הנילוס הוא אחד ממיני דגי המים המתוקים המתורבתים הנפוצים ביותר בעולם והוא מודל מחקר נפוץ לחקר דגי חקלאות ימית. הכנת תרחיפים איכותיים של תא בודד חיונית למחקרים ברמת התא הבודד כגון RNA של תא בודד או ריצוף גנום. עם זאת, אין פרוטוקול מוכן לשימוש עבור מיני דגים חקלאות ימית, במיוחד עבור המעי של אמנון. אנזימי הדיסוציאציה היעילים משתנים בהתאם לסוג הרקמה. לכן, אופטימיזציה של פרוטוקול הדיסוציאציה של רקמות על ידי בחירת שילוב האנזים או האנזים המתאים כדי להשיג מספיק תאים בני קיימא עם נזק מינימלי היא חיונית. מחקר זה מדגים פרוטוקול אופטימלי להכנת תרחיף חד-תאי איכותי ממעי אמנון הנילוס עם שילוב אנזים של collagenase/dispase. שילוב זה יעיל מאוד לדיסוציאציה עם שימוש באלבומין בסרום בקר ו- DNase להפחתת צבירת תאים לאחר העיכול. תפוקת התא עונה על הדרישות לריצוף תא בודד, עם 90% כדאיות התא וריכוז תאים גבוה. פרוטוקול זה יכול גם להשתנות כדי להכין תרחיף חד-תאי מהמעיים של מיני דגים אחרים. מחקר זה מספק פרוטוקול ייחוס יעיל ומפחית את הצורך בניסויים נוספים בהכנת תרחיפים חד-תאיים למיני דגים של חקלאות ימית.

Introduction

תאים הם היחידות הבסיסיות של אורגניזמים. בהשוואה למחקרי רקמות בתפזורת, מחקרים ברמת תא בודד יכולים לשקף הטרוגניות של תאים ולספק מידע ברזולוציה גבוהה יותר¹. בשנים האחרונות, חוקרים יישמו טכנולוגיות ריצוף חד-תאי עבור גנום, שעתוק, אפיגנום או מחקרים רב-אומיים ברמת התא הבודד ביונקים, דגי זברה ואורגניזמים מודל אחרים ודיווחו על פריצות דרך גדולות 2,3,4,5,6,7 . בעוד שרוב המחקרים התמקדו באורגניזמים מודלים, יש מעט פרוטוקולי ייחוס או ערכות דיסוציאציה מסחריות לריצוף חד-תאי במיני דגים כלכליים, מה שמגביל את היישום של ריצוף חד-תאי במחקר חקלאות ימית. לכן, פיתוח פרוטוקולים לדיסוציאציה של רקמות המייצרים תרחיפים חד-תאיים באיכות גבוהה עם כדאיות גבוהה של תאים ושלמות חומצות גרעין הוא חיוני.

מיטוב פרוטוקול הדיסוציאציה של רקמות עם שילוב האנזים או האנזים המתאים כדי להשיג מספיק תאים בני קיימא עם נזק מינימלי הוא חיוני. האנזים היעיל ביותר לדיסוציאציה של רקמות משתנה בהתאם לסוג הרקמה. ביונקים נעשה שימוש במספר אנזימים להכנת תרחיפים חד-תאיים לרקמות מוצקות של יונקים, כולל קולגן, דיספאז, טריפסין, פפאין, אלסטאז, היאלורונידאז, ליבראז, אקוטאז וטריפול ^8,9. עיכול טריפסין בשילוב עם הפרעה מכנית שימש בדרך כלל כדי לנתק רקמות לתרבית תאים בדגים 10,11,12,13,14. טריפסין שימש או נוסף גם לקוקטייל העיכול לדיסוציאציה של רקמות במעי החולדה¹⁵ וברקמת הזימים של דג הזברה¹⁶. עם זאת, מכמה סיבות, טריפסין אינו האפשרות הטובה ביותר עבור ריצוף תא יחיד. טריפסין לבדו בדרך כלל אינו יעיל לדיסוציאציה של רקמות. בנוסף, טריפסין גורם לשבירת גדיל DNA ^17,18 ולפירוק RNA¹⁹.

פפאין מפרק את החלבונים המרכיבים את הצמתים הצפופים בין התאים. בעצב יונקים ובתאי שריר חלקים, פפאין יעיל יותר והרסני פחות מפרוטאזות אחרות^20,21. עם זאת, כמו טריפסין, פפאין גורם לצבירה חופשית של תאים הנגרמת על ידי DNA עקב ליזה התא המתרחשת במהלך עיכול אנזימטי⁹. אלסטאז מפרק אלסטין, הנמצא בדרך כלל בעור, בריאות, ברצועות, בגידים וברקמות כלי הדם²². לעתים קרובות משתמשים בו בשילוב עם collagenase, dispase או טריפסין לניתוק רקמת ריאה⁸. היאלורונידאז קוטע את הקשרים הגליקוזידים של היאלורונן, ותורם לעיכול המטריצה החוץ תאית ברקמות חיבור שונות ובעור ^9,23.

באופן כללי, collagenase ו dispase הם אפשרויות טובות עבור פירוק מטריצה תאיים. הם שימשו בדיסוציאציה של מעיים אנושיים, עכברים ודגי זברה^24,25,26,27. Collagenase הורס את הקשר הפפטידי בקולגן, מקדם את העיכול של המטריצה החוץ תאית ומשחרר את התאים לתרחיף, ולכן collagenase משמש לעתים קרובות לדיסוציאציה של רקמות מוצקות של בני אדם ועכברים, כולל עבור הכבד 28,29, טחול^30, לבלב³¹ ומעי ²⁵. דיספאז הוא פרוטאז שמבצע הידרוליזה של קשרי פפטיד N-טרמינליים של שאריות חומצות אמינו לא קוטביות, והוא עדין יותר מקולגן. הוא מבקע את מרכיבי המטריקס החוץ תאיים, כגון פיברונקטין (fibronectin), קולגן מסוג IV, ובמידה פחותה קולגן מסוג I, מבלי להשפיע על הצטלבויות התא. דיספאז משמש בנפרד או עם אנזימים אחרים לדיסוציאציה של רקמות, כגון עבור מעי^25,32, מוח^33, כבד ³⁴ וכו ‘. נוסף על כך, קוקטיילים מסחריים לעיכול, כולל ליבראז, אקוטאז וטריפל, הם גם חלופות טובות לדיסוציאציה של רקמות מוצקות, במיוחד עבור העור, הכבד והכליות ^8,9.

אמנון הנילוס (Oreochromis niloticus) שייך למשפחה Cichlidae של הסדר Perciformes. זהו אחד ממיני דגי המים המתוקים המתורבתים ביותר באזורים טרופיים וסובטרופיים, עם ייצור שנתי של 4.5 מיליון טון בשנת 2022³⁵. זהו אחד ממיני דגי החקלאות הימית הנחקרים ביותר עם גנום מבואר היטב. אמנון הנילוס הוא מודל מחקר אידיאלי עבור מיני דגים בחקלאות ימית בשל זמן הייצור הקצר שלו, קלות הגידול שלו ויכולת ההסתגלות למגוון רחב של סביבות גידול. המעי הוא בעל עניין מחקרי רב שכן הוא איבר התזונה, העיכול והספיגה, חילוף החומרים ומערכת החיסון הרירית. המעי הוא בית הגידול של אוכלוסיות מיקרוביאליות והוא רקמת חיסון חיונית³⁶. הוא פעיל מבחינה חיסונית בשל נוכחותם של סוגים רבים של תאי חיסון, כולל מקרופאגים, תאי B, גרנולוציטים ותאי T.

במחקר הנוכחי פיתחנו פרוטוקול להכנת תרחיף חד-תאי איכותי ממעי האמנון של הנילוס כדי להקל על מחקרים ברמת התא הבודד במינים של דגי חקלאות ימית. על פי המאפיינים של אנזימים ספציפיים לרקמות אלה ועבודה ראשונית, collagenase/dispase מתאים לניתוק רקמת מעי אמנון. סוג האנזים האחרון שיש לקחת בחשבון בהכנת תרחיפים חד-תאיים הוא DNase-I, המונע צבירת תאים על ידי פירוק דנ”א חופשי המשתחרר דרך ליזה של תאים מתים במהלך עיכול אנזימטי מבלי ליזום מסלולים אפופטוטיים⁹ ומגביר את תפוקת התא החי³⁶. בנוסף, אלבומין בסרום בקר (BSA) מתווסף למאגר הכביסה כדי להפחית את גושי התאים ולשפר את כדאיות התא. מספר חברות ריאגנטים מתארות BSA כמייצב אנזים. תוספת של 0.04%-1% BSA ל-PBS (מלח חוצץ פוספט) שימשה לפיתוח פתרון שטיפה להכנת מתלי ריצוף חד-תאי ללא תופעות לוואי³⁸. תוספת של יחס נמוך של BSA יכולה לעזור לשמור על כדאיות התא ולמנוע הצטברות חופשית של תאים הנגרמת על ידי DNA עקב ליזה של תאים. פרוטוקול זה יכול גם לספק התייחסות רבת ערך לפיתוח פרוטוקולי דיסוציאציה של תאים מהמעיים של מיני דגים אחרים בחקלאות ימית.

Protocol

כל הפרוטוקולים של בעלי חיים במהלך מחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת היינאן (מספר פרוטוקול: HNUAUCC-2022-00063; תאריך אישור: 2022-03-03). רשימה של הציוד והאספקה ששימשו בניסוי זה ניתן למצוא בטבלת החומרים. סיכום הפרוטוקול הנוכחי מתואר באיור 1…

Representative Results

פרוטוקול זה מתאר הכנה של תרחיף חד-תאי באיכות גבוהה של מעי אמנון הנילוס לריצוף חד-תאי (איור 1). מחקר זה מראה כי לתערובת collagenase/dispase יש אפקט דיסוציאציה טוב והיא קלה לרקמת המעי. הבחירה של אנזים העיכול האופטימלי חיונית להכנת תרחיף חד תאי באיכות גבוהה. בעבודה הראשונית הושוותה יעיל?…

Discussion

פרוטוקול זה מתאר הכנה של תרחיף חד תאי באיכות גבוהה של מעי אמנון הנילוס. לפני הדיסוציאציה, הסרת שומן ומזנטריה מהמעי היא הכרחית, במיוחד עבור מעיים דגים טורפים עם שומן רב. שימוש במזרק במקום גירוד קשה כדי לשטוף את תוכן המעי מפחית את הנזק המכני לתאים. כדי להבטיח את כדאיות התא, חיוני גם לשמור על הט…

Materials

0.22-μm Sterile Filter	Solarbio Life Sciences	SLGV033RB	It is used to filter and sterilize the enzyme solution.
40-μm Cell Strainer	Solarbio Life Sciences	F8200	Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	SRE0098	Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 – 8 °C.
Collagenase II	Sangon Biotech	A004202	Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Collagenase/dispase	Roche	10269638-001	Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Dispase	Sigma-Aldrich	D4818	Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
DNase I	Sigma-Aldrich	AMPD1	DNase I helps reduce cell clumping.
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free	Solarbio Life Sciences	E607009-0500	Store at room temperature.
Elastase	Sangon Biotech	A600438	Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL.
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	16000-044	Serum, used at volume of 5% in digetstion solution.
Inverted Microscope	Leica	qTOWER3G	It is used to examine cell viability.
Liberase	Roche	5401119001	Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL.
Nile tilpia (Oreochromis niloticus)	ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd.	NA	Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g).
Phosphate-buffered saline (PBS)	Solarbio Life Sciences	P1020	Store at room temperature.
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5424	It is used to spin down the tissue and cell petet.
RNase inhibitor	NEB	M0314L	Inhibit RNase activity
Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent	Sangon Biotech	B644201-0050	It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature.
Tricaine methanesulfonate (MS-222)	Sigma-Aldrich	E10521	For fish euthanasia.
Trypan Blue	Invitrogen	C0040	It is used for staining dead cells.
Trypsin	Sangon Biotech	E607001	Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.