本方案概述了一种 体外 适用于参与迁移实验的分子功能分析 体内 神经嵴细胞向富含透明质酸的细胞外基质迁移。
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本文内容
摘要
摘要
神经嵴细胞（NCCs）是一类起源于神经管背侧区域的高度迁移性细胞。NCCs从神经管迁移而出是其生成及向靶向部位迁移的关键过程。NCCs的迁移路径及其周围的神经管组织包含富含透明质酸（HA）的细胞外基质。为模拟NCCs从神经管向富含HA的周围组织迁移的过程，本研究建立了一种由HA（平均分子量：1,200–1,400 kDa）与I型胶原蛋白（Col1）组成的混合基质迁移实验。该迁移实验表明，NCC细胞系O9-1细胞在混合基质上具有高度迁移能力，并且在迁移过程中，细胞黏着斑部位的HA涂层被降解。 体外 该模型可用于进一步探索神经嵴细胞迁移的机制基础。本方案也可用于评估不同基质作为支架以研究神经嵴细胞迁移。
引言
神经嵴细胞（NCCs）是一类存在于发育中胚胎的多能细胞群体，起源于神经管形成过程中的神经板边缘。它们参与多种组织的形成，包括周围神经系统、心血管系统、颅面组织以及骨骼1。在神经板边缘发生诱导并确定神经嵴细胞命运后，神经嵴细胞从神经上皮迁移而出，向其衍生组织部位迁移1。
透明质酸（HA）是一种非硫酸化的糖胺聚糖，作为细胞外基质（ECM）的组分广泛分布于多种组织中。在模式系统中，通过敲除透明质酸代谢相关基因，已证实HA在胚胎发育过程中的重要性。例如，在非洲爪蟾（Xenopus）中，透明质酸合成酶基因（Has1 和 Has2）的突变会导致神经嵴细胞（NCC）迁移缺陷以及颅面畸形2。此外，已报道HA结合型蛋白聚糖聚集蛋白聚糖（aggrecan）和多功能蛋白聚糖（versican）对NCC的迁移具有抑制作用3。在小鼠中，Has2基因的缺失会导致心内膜垫形成严重缺陷，从而引起中期妊娠（E9.5–10）致死4,5,6。
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方案
所有实验程序均经大阪大学牙科研究生院动物伦理委员会批准。
1. 小鼠颅神经嵴细胞的培养
注意：本研究中使用的神经嵴细胞系为 O9-1 细胞，最初来源于从 E8.5 小鼠胚胎中分离的 Wnt1-Cre；R26R-GFP 表达细胞12（见讨论部分）。此处所述的 O9-1 细胞培养方法遵循先前建立的方案13。
- 准备包被基底膜基质的培养板。
- 将基底膜基质（参见 材料表）置于冰上解冻。用预冷的1×PBS按1:50稀释基质，并保持在冰上。
- 用10 mL稀释后的基底膜基质溶液包被一个10 cm培养皿。室温孵育1小时，使用前吸除基质溶液。
- 用2 mL PBS洗涤培养皿3次。
- 在包被基底膜基质的培养板上培养O9-1细胞。
- 将完全胚胎干细胞（ES）培养基（参见 材料表）在37 °C水浴中预热。
- 轻轻混匀O9-1细胞悬液（参见 材料表），使用自动细胞计数仪（参见 材料表
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结果
采用本方案所述方法，在由Col1和高分子量HA（平均分子量：1,200–1,400 kDa）组成的混合基质上进行了迁移实验。位于缺口边缘的O9-1细胞可迅速迁入富含HA的缺口区域（图4）。对黏着斑标志物vinculin进行免疫染色14，结果证实O9-1细胞在HA降解位点处形成了黏着斑（FAs）（图5）。
图 1：NCCs 中的 TMEM.......
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讨论
多种细胞外基质（ECM）成分调控神经嵴细胞（NCC）的迁移。例如，透明质酸（HA）对NCC迁移具有正向调控作用2,15。有趣的是，基于Tmem2（一种细胞表面透明质酸酶）基因小鼠模型的研究揭示了HA降解在NCC迁移过程中的必要性9。胶原蛋白在神经管周围ECM中也十分丰富16。研究表明，小型富含亮氨酸的蛋白聚糖——核心蛋白聚糖（decorin）在神经发育过程中调控NCC的迁移17。其他ECM成分，如层粘连蛋白（laminin）和纤连蛋白（fibronectin），也影响NCC的黏附与迁移18。然而，各类ECM成分在NCC迁移中的具体作用仍不明确。
的 体外 本文所述模型旨在研究迁移中的神经嵴细胞（NCCs）在遇到富含透明质酸（HA）的细胞外基质（ECM）时的行为.......
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披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
我衷心感谢 Fumitoshi Irie 和 Yu Yamaguchi 在建立本方法过程中给予的鼓励和宝贵建议。本研究得到了日本促进科学协会科研资助项目（Japan Society for the Promotion of Science）的资助（T.I. 项目编号 #19KK0232，T.I. 项目编号 #20H03896）。 在玻璃基底上包被透明质酸（HA）以及在基底上进行原位 HA 降解检测的原始方法见 Yamamoto 等人（2017）8，而 HA/Col1 混合基底的制备方法见 Irie 等人（2021）7。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 cm 细胞培养皿 | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1× PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2 孔细胞培养插件 | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555 标记的山羊抗小鼠 IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | 来源于山羊的抗小鼠二抗 |
| 自动细胞计数仪 | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | 细胞冻存液 |
| I 型胶原蛋白 | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| 完全 ES 细胞培养基 | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| 胎牛血清 | Gibco | Cat. 10270106 | |
| 荧光显微镜 | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| 荧光标记的透明质酸 | PG Research | FAHA-H2 | |
| 玻璃底培养皿 | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| 戊二醛 | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | 基底膜基质 |
| 单克隆抗连环蛋白抗体 | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| 封片剂 | Dako | S3023 | |
| 正常山羊血清 | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 细胞 | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| 多聚甲醛 | Sigma | Cat. 158127 | |
| 三乙氧基硅烷 | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
参考文献
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326(2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is req....
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