脱细胞软骨细胞外基质水凝胶的制备

摘要

本文介绍了一种制备脱细胞软骨细胞外基质（DC-ECM）水凝胶的新方法。DC-ECM水凝胶具有优异的生物相容性，可为细胞生长提供优越的微环境，因此可作为理想的细胞支架和生物递送系统。

摘要

脱细胞软骨细胞外基质（DC-ECM）水凝胶因其良好的生物相容性以及能够模拟天然组织特性，在组织工程与再生医学领域具有广阔的应用前景。本实验方案旨在制备高度模拟软骨组织天然细胞外基质（ECM）特性的DC-ECM水凝胶。该方法结合物理和化学破碎以及酶消化技术，有效去除细胞成分，同时最大限度保留ECM的结构与组成。随后利用化学交联剂对DC-ECM进行交联，形成稳定且具有生物活性的水凝胶。所获得的DC-ECM水凝胶具备优异的生物活性、空间结构和生物诱导功能，并具有低免疫原性。这些特性有助于促进细胞黏附、增殖、分化和迁移，为细胞生长提供优越的微环境。本方案可为组织工程领域的科研人员与临床医生提供重要参考。仿生水凝胶有望推动软骨修复与再生领域中高效组织工程技术的发展。

引言

软骨组织工程是一个快速发展的领域，旨在再生受损或病变的软骨组织¹。该领域的一个关键挑战是开发能够支持软骨细胞（即负责产生软骨的细胞）生长和分化的仿生支架²。软骨组织的细胞外基质（ECM）在调控软骨细胞行为方面起着至关重要的作用。脱细胞化细胞外基质（DC-ECM）是一种适用于组织工程应用的有效支架³。

已开发出多种技术用于从软骨组织制备脱细胞细胞外基质（DC-ECM），包括化学法、酶解法和物理法。然而，这些方法常产生生物模拟性不足的细胞外基质水凝胶，限制了其在组织工程应用中的潜力^4,5。因此，亟需一种更有效的方法来制备DC-ECM水凝胶。

该技术的开发具有重要意义，因为它为创建可支持组织再生与修复的仿生支架提供了一种新方法，从而推动组织工程领域的发展。此外，该技术可轻松地被改造用于从其他组织制备细胞外基质水凝胶，从而拓展其潜在应用范围。

在更广泛的研究文献中，人们日益关注将脱细胞化细胞外基质（DC-ECM）作为组织工程应用的支架材料⁶。大量研究已证实，DC-ECM....

方案

本研究经浙江省中德医院伦理委员会批准。

1. DC-ECM 水凝胶的制备

注意：本研究中，软骨取自12月龄巴马香猪的膝关节，避免采集骨组织。

1. 取收集的软骨组织，用手术刀切成 1-2 mm³ 大小的块状。
2. 将 20 g 切碎的软骨放入 50 mL 离心管中，加入 20 mL 低渗 Tris-HCl 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0），完全浸没组织。将离心管置于 −80 °C 冰箱中冷冻 3 小时，随后放入 37 °C 烘箱中加热 3 小时。重复冻融过程六次。此步骤中无需更换低渗 Tris-HCl 缓冲液。
3. 使用涡旋振荡器以 1,000 rpm 的速度振荡离心管 30 秒。将不锈钢筛网（孔径：~250 µm）置于新的 50 mL 离心管上。
4. 将脱细胞软骨缓慢倾倒至不锈钢筛网上，用无菌 PBS 洗涤组织三次，并收集软骨。
5. 加入 10 mL 胰蛋白酶溶液（PBS 中含 0.25% 胰蛋白酶），将离心管置于 37 °C 摇床上消化 24 小时。期间每 4 小时更换一次胰蛋白酶溶液。使用不锈钢筛网过滤悬液，并保留组织。在某一次消化过程中，胰蛋白酶可过夜处理，不影响最终消化效果。
6. 用高渗缓冲液（1.5 M NaCl，50 mM Tris-H....

结果

为了制备更优的DC-ECM软骨水凝胶，我们研究并回顾了以往的文献，比较了不同脱细胞化方案在脱细胞率、免疫原性及机械功能方面的表现⁹。

基于此，我们制备了脱细胞软骨细胞外基质（DC-ECM）软骨水凝胶，并探讨了径向取向的提取基质/间充质干细胞外泌体生物墨水在治疗骨软骨缺损中的作用。结果表明，DC-ECM软骨水凝胶具有低免疫原性，能够增强细胞迁移并促进软骨修复¹⁰。

近年来，我们优化了脱细胞软骨基质（DC-ECM）软骨的制备方法。采用上述实验步骤制备脱细胞软骨，结果显示，与天然软骨相比，脱细胞软骨中的DNA含量显著降低（p < 0.001，图1A）。羟脯氨酸检测表明，天然软骨与脱细胞软骨之间的胶原蛋白含量相似（p = 0.48，图1B）。DMMB法检测显示，与天然软骨相比，脱细.......

讨论

本方案提供了一种系统性的方法，用于制备去细胞化软骨细胞外基质水凝胶，该水凝胶可高度模拟软骨组织的天然细胞外基质（ECM）。该方案结合了物理、化学和酶学方法对组织进行破坏，以去除细胞成分，同时保留ECM的结构与组成。方案中的关键步骤包括调整去细胞化的时间和方法，并确保实现完全的去细胞化。

与其他现有的组织工程和再生医学方法相比，本方案具有多项优势。脱细胞细胞外基质（DC-ECM）水凝胶具有优异的生物活性、空间结构和生物学诱导功能，且免疫原性低，这些特性有利于促进细胞黏附、增殖、分化和迁移¹¹。此外，DC-ECM水凝胶还可用于药物递送和软骨缺损治疗¹²。

对该方案的一种改进是使用不同的交联剂以增强水凝胶的机械性能。例如，可采用纳米金属材料来改善水凝胶的机械性能¹³。此外，还可优化核黄素的浓度以及紫外光照射时间，以调控水凝胶的压缩强度和拉伸强度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 M Tris-HCl，pH 7.6	Beyotime	ST776-100 mL
1 M Tris-HCl，pH 8.0	Beyotime	ST780-500 mL
-80 °C 型冷冻机	Eppendorf	F440340034
脱氧核糖核酸酶	Aladdin	D128600-80KU
DNEasy 血液 &Tissue 试剂盒	Qiagen	69506号
糖胺聚糖比色法定量检测试剂盒	上海哈灵	HL19236.2
HCP-2 干燥器	日立	N/A
Nanodrop8000	赛默飞世尔科技	N/A	分光光度计
PBS（10倍浓缩液）	Gibco	70011044
核糖核酸酶	Aladdin	R341325-100 mg
Sigma500	ZIESS	N/A	扫描电子显微镜
光谱 S	赛默飞世尔科技	N/A	透射电子显微镜
不锈钢筛网	SHXB-Z-1	上海新埠
Triton X-100	Beyotime	P0096-500 mL
胰蛋白酶	Gibco	15050065
紫外灯	Omnicure 2000	N/A
维生素B2	Gibco	R4500-5G
涡旋混合器	上海启森	78HW-1