Summary

Изучение эпителиальных эффектов воспаления кишечника in vitro на установленных колоноидах мышей

Published: June 02, 2023
doi:

Summary

Мы описываем протокол, подробно описывающий изоляцию крипт толстой кишки мышей для развития трехмерных колоноидов. Затем сформированные колоноиды могут быть терминально дифференцированы, чтобы отразить клеточный состав эпителия хозяина до того, как они получат воспалительную инструкцию или будут направлены на создание эпителиального монослоя.

Abstract

Кишечный эпителий играет важнейшую роль в здоровье человека, обеспечивая барьер между хозяином и внешней средой. Этот высокодинамичный клеточный слой обеспечивает первую линию защиты между микробными и иммунными популяциями и помогает модулировать иммунный ответ кишечника. Нарушение эпителиального барьера является отличительным признаком воспалительного заболевания кишечника (ВЗК) и представляет интерес для терапевтического таргетирования. 3-мерная колоноидная культуральная система является чрезвычайно полезной моделью in vitro для изучения динамики стволовых клеток кишечника и физиологии эпителиальных клеток в патогенезе ВЗК. В идеале, создание колоноидов из воспаленной эпителиальной ткани животных было бы наиболее полезным для оценки генетического и молекулярного влияния на заболевание. Однако мы показали, что эпителиальные изменения in vivo не обязательно сохраняются у колоноидов, полученных от мышей с острым воспалением. Чтобы устранить это ограничение, мы разработали протокол лечения колоноидов коктейлем медиаторов воспаления, которые обычно повышены во время ВЗК. Несмотря на то, что эта система может применяться повсеместно в различных условиях культивирования, этот протокол делает акцент на обработке как дифференцированных колоноидов, так и двухмерных монослоев, полученных из установленных колоноидов. В условиях традиционной культуры колоноиды обогащаются стволовыми клетками кишечника, обеспечивая идеальную среду для изучения ниши стволовых клеток. Однако эта система не позволяет провести анализ особенностей физиологии кишечника, таких как барьерная функция. Кроме того, традиционные колоноиды не дают возможности изучать клеточный ответ терминально дифференцированных эпителиальных клеток на провоспалительные раздражители. Методы, представленные здесь, представляют собой альтернативную экспериментальную основу для устранения этих ограничений. Двухмерная монослойная культуральная система также дает возможность проведения терапевтического скрининга лекарственных средств ex vivo. Этот поляризованный слой клеток может быть обработан медиаторами воспаления на базальной стороне клетки и одновременно с предполагаемой терапией апикально, чтобы определить их полезность в лечении ВЗК.

Introduction

Воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) — это хроническое, ремиттирующее и рецидивирующее заболевание, характеризующееся эпизодами воспаления и клиническим покоем. Этиология ВЗК является многофакторной, но ключевыми характерными особенностями заболевания являются дефектная барьерная функция и повышенная проницаемость кишечного эпителия, а также провоспалительные сигнальные каскады, активированные в эпителиальном компартменте 1,2. Для повторения эпителиального ответа во время ВЗК было использовано несколько моделей in vitro и in vivo, включая клеточные культуры и мышиные модели воспаления3. Однако все эти системы имеют существенные недостатки, которые ограничивают их способность повторять эпителиальные изменения во время ВЗК4. Большинство клеточных линий, используемых для изучения ВЗК, трансформируются, обладают способностью образовывать монослой и могут дифференцироваться3, но по своей природе размножаются иначе, чем нетрансформированные эпителиальные клетки кишечника в организме хозяина. Для изучения ВЗК используется несколько различных мышиных моделей воспаления, некоторые из которых включают нокаутные модели, инфекционные модели, химические воспалительные модели и модели переноса Т-клеток 5,6,7,8. Хотя каждый из них может изучать определенные этиологические аспекты ВЗК, такие как генетическая предрасположенность, барьерная дисфункция, иммунная дерегуляция и микробиом, они ограничены в своих возможностях изучать многофакторную природу заболевания.

За последнее десятилетие было установлено, что кишечные органоиды, включая энтероиды и колоноиды, являются полезной моделью in vitro для изучения не только динамики кишечных стволовых клеток, но и их роли, барьерной целостности и функции кишечного эпителия в кишечном гомеостазе и заболевании. Эти сущности внесли значительный вклад в наше понимание патогенеза ВЗК9 и открыли новые возможности для персонализированной медицины. Колоноиды, или самоорганизующиеся культуры тканей толстой кишки, полученные из стволовых клеток, были выведены как из мышиных, так и из человеческих тканей в процессе, который позволяет стволовым клеткам, находящимся в кишечных криптах, размножаться и поддерживаться втечение неопределенного времени. Ниша стволовых клеток in vivo зависит от внеклеточных факторов для поддержки их роста, в частности, канонических сигнальных путей Wnt и сигнальных путей костного морфогенного белка11. Добавление этих факторов способствует здоровью и долголетию колоноидов, но также приводит культуру к состоянию, подобному стволовым клеткам, которое не отражает клеточную архитектуру эпителия in vivo, которая состоит как из самообновляющихся, так и из терминально дифференцированных клеток12,13. В то время как функциональность кишечного эпителия зависит от постоянных перекрестных помех между компартментом стволовых клеток и дифференцированными клетками, возможность иметь и то, и другое в системе колоноидных культур довольно ограничена. Несмотря на эти ограничения, система органоидных культур остается золотым стандартом для изучения внутренних свойств эпителия ex vivo. Тем не менее, для ответа на поставленный научный вопрос, возможно, потребуется рассмотреть альтернативные культурные стратегии.

Было показано, что у мышей, получающих непрерывный 7-дневный режим приема декстрана сульфата натрия (DSS), развивается как воспаление эпителия, так и барьерная дисфункция14. Кроме того, сбой митохондриального биогенеза и метаболическое перепрограммирование в кишечном эпителии, которые, как было показано, проявляются при ВЗК человека, также были учтены в этой DSS-модели колита15. Тем не менее, наши предварительные данные показывают, что характеристики недостаточности митохондриального биогенеза не сохраняются у колоноидов, полученных из крипт животных, обработанных DSS (дополнительный рисунок 1). Таким образом, при изучении того, как воспаление приводит к эпителиальным изменениям при воспалении кишечника мышей, необходимо использовать альтернативные методы культивирования. Здесь мы излагаем разработанный нами протокол, который описывает: 1) как изолировать крипты от всей ткани толстой кишки для создания мышиных колоноидов, 2) как терминально дифференцировать эту клеточную популяцию, чтобы отразить клеточную популяцию в том виде, в каком она существует in vivo, и 3) как индуцировать воспаление в этой модели in vitro . Для изучения лекарственных взаимодействий в воспаленном эпителии мы разработали протокол для создания 2-мерных (2D) монослоев из мышиных колоноидов, которые могут быть базально обработаны медиаторами воспаления и апикально обработаны лекарственной терапией.

Protocol

Все эксперименты с использованием мышиных тканей, описанные в настоящем документе, были одобрены Институциональным наблюдательным советом Университета Питтсбурга и проведены в соответствии с руководящими принципами, установленными Комитетом по исследованиям и уходу за животными в …

Representative Results

3D система культивирования кишечных колоноидов является бесценным инструментом для изучения внутреннего вклада эпителия в гомеостаз слизистой оболочки кишечника. Описанный протокол содержит подробные инструкции о том, как изолировать крипты от мышей C57BL/6J (WT) в возрасте 8 недель и созд…

Discussion

Разработка органоидов произвела революцию в том, как научное сообщество изучает системы органов in vitro , с возможностью частичного повторения клеточной структуры и функции животного или человека в чашке. Кроме того, органоидные системы, полученные от людей с заболеваниями, предлаг?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения R01DK120986 (K.P.M.).

Materials

0.4-μM transparent transwell, 24-well Greiner Bio-one 662-641
15-mL conical tubes Thermo Fisher  12-565-269
50-mL conical tubes Thermo Fisher  12-565-271
70-μM cell strainer VWR 76327-100
Advanced DMEM/F12 Invitrogen 12634-010 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement  Invitrogen 12587-010 Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO World Precision Instruments STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix Corning 354-230 Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D0632-5G Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose Thermo Fisher 11960-069 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium Gibco  14190-144 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) Sigma-Aldrich E7889 Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum Bio-Techne S11150H Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm Thermo Fisher  12-550-15
G418 InvivoGen ant-ga-1 Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent Gibco/Fisher 15750-060 Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1 Fisher Scientific 35050-061 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M Gibco 15630-080 Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ R&D Systems 285-IF Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β R&D Systems 201-LB Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα R&D Systems 210-TA Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide  Sigma H1009 Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold InvivoGen ant-hg-1 Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line ATCC CRL-3276
mEGF Novus NBP2-35176 Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement Invitrogen 17502-048 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine Sigma  A9165-5G Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin Peprotech 250-38 Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher 15140-122 Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable VWR 25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile Greiner Bio-one 5666-2160
R-Spondin R&D Systems 3474-RS-050 Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express Thermo Fisher 12604-013 Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water  Invitrogen 10977-023 Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride  Abcam ab120129 Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)

References

  1. Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
  2. McGuckin, M. A., Rajaraman, E., Simms, L. A., Florin, T. H. J., Radford-Smith, G. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (1), 100-113 (2009).
  3. Joshi, A., Soni, A., Acharya, S. In vitro models and ex vivo systems used in inflammatory bowel disease. In Vitro Models. 1 (3), 213-227 (2022).
  4. Goyal, N., Rana, A., Ahlawat, A., Bijjem, K. R., Kumar, P. Animal models of inflammatory bowel disease: A review. Inflammopharmacology. 22 (4), 219-233 (2014).
  5. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: Concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (2), 135-146 (2009).
  6. Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: Studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. (72), e50222 (2013).
  7. Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunological Reviews. 169, 195-207 (1999).
  8. Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
  9. Dotti, I., Salas, A. Potential use of human stem cell-derived intestinal organoids to study inflammatory bowel diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (12), 2501-2509 (2018).
  10. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  11. Santos, A. J. M., Lo, Y. H., Mah, A. T., Kuo, C. J. The intestinal stem cell niche: Homeostasis and adaptations. Trends in Cell Biology. 28 (12), 1062-1078 (2018).
  12. Yin, X., et al. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
  13. Wilson, S. S., et al. Optimized culture conditions for improved growth and functional differentiation of mouse and human colon organoids. Frontiers in Immunology. 11, 547102 (2021).
  14. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), e3678 (2012).
  15. Cunningham, K. E., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1-α (PGC1α) protects against experimental murine colitis. Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10184-10200 (2016).
  16. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2481 (2013).
  17. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  18. Julian, M. W., et al. Intestinal epithelium is more susceptible to cytopathic injury and altered permeability than the lung epithelium in the context of acute sepsis. International Journal of Experimental Pathology. 92 (5), 366-376 (2011).
  19. Haberman, Y., et al. Ulcerative colitis mucosal transcriptomes reveal mitochondriopathy and personalized mechanisms underlying disease severity and treatment response. Nature Communications. 10, 38 (2019).
  20. Yang, S., et al. Mitochondrial transcription factor A plays opposite roles in the initiation and progression of colitis-associated cancer. Cancer Communications. 41 (8), 695-714 (2021).
  21. Maidji, E., Somsouk, M., Rivera, J. M., Hunt, P. W., Stoddart, C. A. Replication of CMV in the gut of HIV-infected individuals and epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathogen. 13, 1006202 (2017).
  22. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 452-470 (2017).
  23. Grondin, J., Kwon, Y., Far, P., Haq, S., Khan, W. Mucins in Intestinal mucosal defense and inflammation: Learning from clinical and experimental studies. Frontiers in Immunology. 11, 2054 (2020).
  24. Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
  25. Yui, S., et al. YAP/TAZ-Dependent reprogramming of colonic epithelium links ECM remodeling to tissue regeneration. Cell Stem Cell. 22 (1), 35-49 (2018).
  26. Komiya, Y., Habas, R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 4 (2), 68-75 (2008).

Play Video

Cite This Article
Crawford, E., Mentrup, H. L., Novak, E. A., Mollen, K. P. Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids. J. Vis. Exp. (196), e64804, doi:10.3791/64804 (2023).

View Video