DNA virüslerinin eser tespiti için rekombinaz polimeraz amplifikasyonunu bir CRISPR/Cas12a sistemi ile birleştiren bir protokol sunuyoruz ve hasta başı DNA virüsü tespiti için yapay zeka destekli bir sınıflandırma ile taşınabilir akıllı telefon mikroskobu oluşturuyoruz.
DNA virüslerinin eser tespiti için rekombinaz polimeraz amplifikasyonu (RPA) ve CRISPR/Cas12a sistemini birleştiren hızlı, uygulaması kolay, son derece hassas, diziye özgü ve bakım noktası (POC) DNA virüsü tespit sistemini rapor ediyoruz. Hedef DNA, RPA ve CRISPR/Cas12a tarafından ayrı ayrı amplifiye edilir ve tanınır, bu da Cas12a’nın florofor söndürücü etiketli bir DNA raportörünü parçalayan ve floresansı genelleştiren kollateral bölünme aktivitesini tetikler. POC tespiti için taşınabilir akıllı telefon mikroskobu, floresan görüntüler çekmek üzere üretilmiştir. Ayrıca, pozitif veya negatif numunelerin ikili sınıflandırması için derin öğrenme modelleri, yüksek doğruluk elde ederek sistem içinde konuşlandırılır. Kurbağa virüsü 3 (FV3, cins Ranavirus, Iridoviridae familyası) bu DNA virüsü POC tespit sistemi için bir örnek olarak test edilmiştir ve tespit sınırları (LoD) 40 dakika içinde 10’ye ulaşabilir. Yetenekli operatörler ve hantal cihazlar olmadan, yapay zeka (AI) destekli sınıflandırmaya sahip taşınabilir ve minyatür RPA-CRISPR/Cas12a-SPM, POC DNA virüsü tespiti için büyük potansiyel gösterir ve bu tür virüslerin yayılmasını önlemeye yardımcı olabilir.
Son yıllarda, 20141 ve 20182’de Ebola virüsü hastalığı (EVH) salgını, 2015’te Orta Doğu Solunum Sendromu (MERS)3, 2015’te Zika virüsü hastalığı salgını4, şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2’nin neden olduğu Koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19) dahil olmak üzere farklı virüslerin neden olduğu bulaşıcı hastalık salgınları sık sık meydana gelmiştir.5 ve 2022’de Maymun Çiçeği virüsünün (MKPV) neden olduğu devam eden Maymun Çiçeği (MKPV)6‘dir. Salgın bulaşıcı hastalıkların bu ani salgınları çok sayıda ölüme neden olmakta ve büyük ekonomik kayıplar ve sosyal huzursuzluk getirmektedir. Enfeksiyonu hızlı bir şekilde teşhis etmek ve virüsün daha fazla yayılmasını önlemek için acilen hızlı ve doğru bir tespit sistemi gereklidir.
Son zamanlarda, kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) ve CRISPR ile ilişkili (Cas) proteinler dünya çapında ilgi görmüş ve nükleik asit tespitinde umut verici sonuçlar göstermiştir 7,8,9,10,11,12,13,14,15 . CRISPR RNA (crRNA) tarafından yönlendirilen CRISPR/Cas12a proteini, hedef DNA’ya bağlanır ve onu parçalar. Bu aktivite, trans-bölünme olarak bilinen spesifik olmayan tek sarmallı DNA’nın (ssDNA) salınmasına yol açar ve nükleik asit tespiti için algılama sinyalini geliştirmek için kullanılabilir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) gibi bazı geleneksel tespit yöntemleri, bakım noktası (POC) tespiti için karmaşık, zaman alıcı ve maliyetlidir. Önceki çalışmamız, CRISPR / Cas12a teknolojisine dayalı Afrika domuz ateşi virüsü (ASFV) için otomatik, entegre ve uygun maliyetli bir tespit sistemini başarıyla geliştirdi. Bu sistemde, amplifikasyona ihtiyaç duymadan 2 saatlik bir zaman dilimi içinde 1 pM’lik bir algılama limitine ulaştık. CRISPR/Cas12a sistemi ve rekombinaz polimeraz amplifikasyonu (RPA), eser DNA tespiti için duyarlılığı ve özgüllüğü geliştirmek üzere birleştirilmiştir. Diğer izotermal amplifikasyon teknikleriyle karşılaştırıldığında, RPA’nın tasarımı basittir ve karmaşık sıcaklık kontrol ekipmanı olmadan daha kısa bir reaksiyon süresine sahip olduğu için kullanımı kolaydır.
Patojenlerin POC tespiti için, sonuç okumaları 16,17,18 için akıllı telefon mikroskobu (SPM), el tipi florimetre veya yanal akış şeritleri gibi aletler geliştirilmiştir. SPM, görüntüleri bir kamera aracılığıyla yakalar ve hızlı veri analizi için bazı mobil uygulamalara yükler. Bu tür bir mikroskopi, yüksek hassasiyete sahip taşınabilir, ucuz ve minyatür bir sinyal toplama sistemi yapar ve H5N1, Zika virüsü ve SARS-CoV-219,20 gibi patojenleri tespit etmede avantajlar göstermiştir. Bu nedenle, hedef DNA virüsünün RPA-CRISPR/Cas12a tespiti tarafından tetiklenen floresan sinyallerini yakalamak için taşınabilir bir SPM oluşturuyoruz. Bir florofor ve bir söndürücüyü birbirine bağlayan ssDNA raportör probu, CRISPR / Cas12a hedef DNA virüsünü tanıdığında parçalanacak ve florofor tarafından yayılan floresan SPM tarafından yakalanabilir.
SPM21’den gelen floresan görüntülerinden sonuç bilgilerini elde etmek için genellikle kullanılan profesyonel yazılımla karşılaştırıldığında, bazı uzmanlar, floresan görüntüleri22 elde ettikten sonra virüs DNA konsantrasyonlarını ölçmek için makine öğrenimi ve derin öğrenmeyi kullanır, bu da daha fazla zaman alıcıdır. Tıbbi görüntülerin sınıflandırılması söz konusu olduğunda, geleneksel sinir ağları (CNN’ler) genellikle ham pikselli görüntülerden uçtan uca bir şekilde özellikleri öğrenmek için kullanılır 23,24,25,26. AlexNet, DenseNet-121 ve EfficientNet-B7 gibi popüler CNN tabanlı derin öğrenme modelleri bu alanda başarıyla uygulanmıştır27,28. Bununla birlikte, belirli alanlarda büyük veri setleri elde etmek zor olabilir ve bu da transfer öğrenmeyi gerektirir29,30. Bu yaklaşım, büyük bir veri kümesine sahip bir derin öğrenme modelini önceden eğitir ve önceden eğitilmiş model, küçük bir veri kümesine sahip yeni bir görev için başlangıç noktası olarak kullanılır. Bu teknik, büyük veri kümelerine olan ihtiyacı azaltabilir, aşırı öğrenmeyle mücadele edebilir ve eğitim süresini azaltabilir31. Burada, pozitif ve negatif numunelerin floresan görüntülerinin ikili sınıflandırması için transfer öğrenmeli derin öğrenme modellerini kullanıyoruz.
Bu yöntemde, DNA virüslerinin iz tespiti için RPA ve CRISPR/Cas12a sistemini birleştiriyoruz. Hedef DNA, RPA ve CRISPR/Cas12a tarafından ayrı ayrı amplifiye edilir ve tanınır, bu da Cas12a’nın florofor söndürücü etiketli bir DNA raportörünü parçalayan ve floresansı genelleştiren kollateral bölünme aktivitesini tetikler. POC tespiti için floresan görüntüleri almak ve ikili sınıflandırma için derin öğrenme modelleri geliştirmek için taşınabilir bir SPM oluşturuyoruz. Yerleşik POC algılama sisteminin şeması Şekil 1’de gösterilmiştir. Yetenekli operatörler ve hantal cihazlar olmadan, yapay zeka (AI) destekli sınıflandırmaya sahip RPA-CRISPR/Cas12a-SPM, POC DNA virüsü tespiti için büyük potansiyel gösterir.
Şekil 1: RPA-CRISPR/Cas12-SPM algılama sisteminin şeması ve toplanan görüntüler için yapay zeka sınıflandırması. Hayvansal kaynaklı örneklerin nükleik asitleri PINDBK tarafından salınır. Virüsün Hedef DNA’sı, RPA-CRISPR/Cas12a sistemi tarafından özel olarak amplifiye edilir ve tanınır. CRISPR/Cas12a, crRNA ile bağlanır ve Cas12a-crRNA kompleksi, hedef DNA ile bağlanır, bu da ssDNA raportör problarında CRISPR/Cas12a’nın kollateral bölünmesini tetikler. Raportör üzerindeki florofor serbest bırakılır ve floresan, ticarileştirilmiş bir plaka okuyucu veya oluşturduğumuz SPM tarafından algılanır. Floresan görüntülerini sınıflandırmak için AlexNet, DenseNet-121 ve transfer öğrenmeli EfficientNet-B7 dahil olmak üzere üç farklı derin öğrenme modeli kullanılır. Bu figür Lei ve ark.35’in izniyle yeniden kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bu yöntemde yapay zeka yardımıyla hızlı, uygulaması kolay, son derece hassas, diziye özgü ve POC DNA virüsü tespit sistemi geliştiriyoruz. Numuneler alındıktan sonra, hedef diziyi amplifiye etmek için RPA uygulanır ve ardından CRISPR/Cas12a, hedef DNA’yı tanıyabilir ve algılama sinyalini büyüten floresan serbest bırakabilir. Taşınabilir akıllı telefon mikroskobu, floresan görüntüleri almak için üretilmiştir ve pozitif ve negatif numunelerin görüntülerinin ikili sınıflandırması için…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı 31970752, Shenzhen Belediyesi Bilim, Teknoloji, İnovasyon Komisyonu JCYJ20190809180003689, JSGG20200225150707332, JSGG20191129110812708, WDZC20200820173710001; Shenzhen Körfezi Laboratuvarı Açık Finansmanı, SZBL2020090501004; Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı 2020M680023; ve Çin Halk Cumhuriyeti Gümrük Genel İdaresi 2021HK007.
20x amplification | OLYMPUS | OPLN20X | |
532 nm green laser | Thorlabs | PL201 | with 0.9 mW output power |
535 nm cutoff wavelength | chrome | AT535 | |
6x DNA loading buffer | Thermo scientific | R0611 | |
96-well black microplate | Corning Incorporated | 3603 | Black with flat clear bottom |
Aspherical lens | Lubang | N/A | |
Bandpass filter | SEMROCK | FF01-542/27-25 | |
Bsu DNA Polymerase | ATG Biotechnology | M103 | Large Fragment |
crRNA | Sangon Biotech | N/A | |
DNA fragments | Sangon Biotech | N/A | |
Dichroic holders | Ruicage | N/A | |
Dichroic mirror | SEMROCK | FF555-Di03-25×36 | with a cutoff wavelength of 535 nm |
E.Z.N.A Gel Extraction Kit | Omega Biotek | D2500-02 | |
EnGen Lba Cas12a (Cpf1) | New England Biolabs (Beijing) LTD | M0653T | |
Filter holders | Ruicage | N/A | |
Fluorophore-ssDNA-Quencher reporter probes | Sangon Biotech | N/A | TAMRA (carboxy tetramethylrhodamine) as the fluorophore at the 5 ends; BHQ2 (Black Hole Quencher-2) as the quencher at the 3 ends |
GP32 | ATG Biotechnology | M104 | |
ImageJ | Open-source | Version 1.53t 24 | Downloaded from https://imagej.nih.gov/ij/ |
Microplate reader | SPARK, TECAN | N/A | |
Multi-Block thermal Cycler PCR instrument | LongGene | N/A | |
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
NEBuffer r2.1 | New England Biolabs (Beijing) LTD | B6002S | 10x CRISPR/Cas12a Reaction buffer |
Oxygen plasma treatment | Electro-Technic Products | N/A | |
Pathogen Inactivate, Nucleic acid extraction-free, Direct-to-PCR Buffer with Proteinase K (PINDBK) | Ebio | PINDBK -25mL | |
PCR primer pairs | Sangon Biotech | N/A | |
PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
RPA primer pairs | Sangon Biotech | N/A | |
Smartphone | Huawei | Mate10 | |
Translation stages | Ruicage | N/A | |
Transmitted neutral density filters | Thorlabs | ND40A | |
Triplet achromatic lenses | Thorlabs | TRH127-020-A | |
UvsX | ATG Biotechnology | M105 | |
UvsY | ATG Biotechnology | M106 |