Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Прогнозирование сетевой фармакологии и экспериментальная проверка механизма действия Trichosanthes-Fritillaria thunbergii против аденокарциномы легкого

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64847
Automatic Translation
1, 1, 1, 2
1Dongzhimen Hospital affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, 2Traditional Chinese Medicine Department, Peking University People's Hospital

Summary

Данное исследование раскрывает механизм применения Trichosanthes-Fritillaria thunbergii в лечении аденокарциномы легкого на основе сетевой фармакологии и экспериментальной верификации. Исследование также демонстрирует, что сигнальный путь PI3K/AKT играет жизненно важную роль в действии Trichosanthes-Fritillaria thunbergii при лечении аденокарциномы легкого.

Abstract

Мы стремились изучить механизм Trichosanthes-Fritillaria thunbergii в лечении аденокарциномы легкого (LUAD) на основе сетевой фармакологии и экспериментальной проверки. Эффективные компоненты и потенциальные мишени Trichosanthis и Fritillaria thunbergii были собраны с помощью высокопроизводительных экспериментальных и эталонных (HERB) баз данных традиционной китайской медицины и базы данных ансамблевого подхода подобия (SEA), а мишени, связанные с LUAD, были запрошены базами данных GeneCards и Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Сеть «лекарственный компонент-болезнь-мишень» была построена с помощью программного обеспечения Cytoscape. Для получения основных мишеней и ключевых путей были проведены анализ белково-белкового взаимодействия (PPI), функции онтологии генов (GO) и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG). Для последующей экспериментальной проверки использовали водный экстракт клеток Trichosanthes-Fritillaria thunbergii и A549. С помощью базы данных HERB и поиска литературы было отобрано 31 эффективное соединение и 157 потенциальных генов-мишеней Trichosanthes-Fritillaria thunbergii, из которых 144 были регуляторными мишенями Trichosanthes-Fritillaria thunbergii при лечении аденокарциномы легкого. Анализ функционального обогащения GO показал, что механизм действия Trichosanthes-Fritillaria thunbergii против аденокарциномы легкого в основном заключается в фосфорилировании белка. Анализ обогащения пути KEGG показал, что лечение аденокарциномы легкого Trichosanthes-Fritillaria thunbergii в основном включает сигнальный путь PI3K / AKT. Экспериментальная проверка показала, что водный экстракт Trichosanthes-Fritillaria thunbergii может ингибировать пролиферацию клеток A549 и фосфорилирование AKT. С помощью сетевой фармакологии и экспериментальной проверки было подтверждено, что сигнальный путь PI3K / AKT играет жизненно важную роль в действии Trichosanthes-Fritillaria thunbergii при лечении аденокарциномы легкого.

Introduction

Рак легких относится к злокачественным опухолям, происходящим из слизистой оболочки бронхов легких, включая плоскоклеточный рак, аденокарциному, крупноклеточный рак и мелкоклеточный рак1. Аденокарцинома легкого (LUAD) является наиболее распространенным типом рака легких, на который приходится около 40% от общего числа случаев рака легких2. Большинство пациентов диагностируются на поздней стадии или имеют отдаленные метастазы и, таким образом, теряют возможность хирургического вмешательства3. В современном клиническом лечении одновременная химиолучевая терапия является наиболее распространенной стратегией лечения ЛУАД, но ее применение ограничено из-за серьезных побочных реакций4.

Традиционная китайская медицина (ТКМ) может эффективно облегчить клинические симптомы пациентов с LUAD и уменьшить побочные реакции, вызванные лучевой терапией и химиотерапией, и, таким образом, стала горячей точкой исследований 5,6,7. В традиционной китайской медицине рак легких относится к категории «скопление легких» и «легочный камень». Дефицит Ци и взаимодействие мокроты, застоя и яда имеют важное значение в патогенезе рака легких. Таким образом, тонизирование Ци и устранение мокроты и застоя крови являются основными методами клинического лечениярака легких 8 согласно теории ТКМ9. Trichosanthes kirilowii Maxim (Gualou) и Fritillaria thunbergii Miq (Zhebeimu) представляют собой распространенную пару лекарств при лечении рака легких, и эта комбинация обладает эффектами очищения тепла и уменьшения мокроты10,11,12. Однако механизм его действия до сих пор неясен, и необходимо провести дальнейшие исследования.

Сетевая фармакология — это комплексный метод, основанный на теории системной биологии и разнонаправленной фармакологии, целью которого является выявление сложных сетевых взаимосвязей между несколькими лекарствами и заболеваниями13. Традиционные китайские рецепты обладают характеристиками многокомпонентности и многонаправленности, что означает, что они очень подходят для изучения сетевой фармакологии14,15. В последнее время сетевая фармакология стала мощным подходом к изучению формул ТКМ и стала горячей точкой исследований16,17.

Однако, насколько нам известно, все исследования по сетевой фармакологии представлены в виде текста. Представление этой технологии с помощью видео значительно снизит порог обучения и облегчит продвижение этой технологии, что является одним из преимуществ этой статьи. В этом исследовании мы взяли Trichosanthes-Fritillaria thunbergii против аденокарциномы легкого в качестве примера для прогнозирования сетевой фармакологии и экспериментальной проверки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры сетевой фармакологии проводились в соответствии с Руководством по методам оценки сетевой фармакологии18. Все экспериментальные процедуры были выполнены в соответствии с правилами управления лабораторией Пекинского университета китайской медицины.

1. Сетевое фармакологическое предсказание

  1. Подбор активных компонентов
    1. Откройте базу данных HERB (http://herb.ac.cn)19 и используйте «Gualou» (китайское название Trichosanthes kirilowii Maxim) и «Zhebeimu» (китайское название Bulbus Fritillariae thunbergii) в качестве ключевых слов для получения компонентов двух препаратов. Загрузите список и канонические структуры SMILES родственных компонентов двух препаратов.
    2. Определите, является ли полученный компонент активным.
      1. Включите в качестве активных компонентов те, которые имеют пероральные значения биодоступности (OB) и лекарственные (DL) значения в базе данных группы HERB (т.е. компоненты с OB ≥ 30% и DL ≥ 0,18)20,21.
      2. Если компонент не имеет значений OB и DL, введите компонент в швейцарскую базу данных ADME (http://www.swissadme.ch/index.php)22, чтобы получить сведения о каждом компоненте. Включите компоненты с «высоким» поглощением ГИ и по крайней мере двумя значениями DL «Да» в качестве активных компонентов.
  2. Целевое прогнозирование активных компонентов
    1. Откройте базу данных HERB (http://herb.ac.cn). Поиск и копирование канонических структур активных компонентов SMILES.
    2. Откройте базу данных SEA (Similarity ensemble approach, http://sea.bkslab.org)23. Вставьте канонические структуры SMILES активных компонентов в поле поиска и нажмите « Попробовать SEA », чтобы получить целевой ключ, целевое имя, P-значение и MaxTC каждого активного компонента.
    3. Скопируйте данные в электронную таблицу и используйте функцию фильтрации файла электронной таблицы, чтобы отфильтровать целевые объекты активных компонентов по целевому ключу (Human, P < 0.05 и MaxTC > 0.5).
    4. Скопируйте все мишени в электронную таблицу и удалите дубликаты, чтобы получить мишени для лекарств.
  3. Прогнозирование мишеней для болезней
    1. Откройте базу данных GeneCards (https://www.genecards.org)24 и онлайн-базу данных Mendelian Inheritance in Man (OMIM, https://www.omim.org)25 и используйте аденокарциному легкого в качестве ключевого слова для получения мишеней аденокарциномы легкого.
    2. Загрузите электронные таблицы с целевыми показателями заболевания. Удалите повторяющиеся цели, чтобы получить цели LUAD.
  4. Создание целевой сети по лекарственным компонентам и болезням
    1. Скопируйте мишени, связанные с LUAD, и мишени для лекарств в один и тот же столбец в новой электронной таблице. Используйте функцию «Данные - Идентификация дубликатов» на панели инструментов для получения целевых объектов, связанных с LUAD, и целевых объектов, связанных с активными компонентами Trichosanthes-Fritillaria thunbergii .
    2. Откройте Cytoscape 3.8.0. Нажмите « Файл » в строке меню, а затем выберите «Импортировать > сеть из файла », чтобы импортировать файл электронной таблицы. Оптимизируйте размер и цвет узлов сети с помощью панели стилей в левой панели управления.
    3. Используйте функцию «Анализ сети» для анализа топологии сети. Нажмите « Инструменты » в строке меню, а затем выберите «Анализировать сеть». На панели « Таблица » нажмите « Степень » в строке заголовка, чтобы упорядочить компоненты по градусам в порядке убывания. Возьмите десять основных компонентов и целей в качестве основных активных компонентов и основных целей.
  5. Построение сети ИПП и скрининг основных белков
    1. Откройте базу данных STRING (https://cn.string-db.org/)26. Вставьте текстовый список потенциальных мишеней Trichosanthes-Fritillaria thunbergii против LUAD в диалоговое окно «Список имен ». Выберите Homo sapiens в разделе « Организмы» и нажмите кнопки « ПОИСК» > «ПРОДОЛЖИТЬ ».
    2. Когда результаты будут доступны, нажмите « Настройки» и отметьте « Высокая достоверность» (0,700) в разделе «Основные настройки» > «Минимальная требуемая оценка взаимодействия». Поставьте галочку напротив пункта « Скрыть отключенные узлы в сети» в разделе «Дополнительные настройки», а затем нажмите кнопку «ОБНОВИТЬ ».
    3. Нажмите « Экспорт » в строке заголовка и загрузите короткий табличный текст отношения PPI в формате TSV.
    4. Откройте Cytoscape 3.8.0. Нажмите « Файл» > «Импортировать > сеть из файла », чтобы импортировать файл формата TSV для визуального анализа.
    5. Используйте функцию Network Analyzer для проведения топологического анализа. Оптимизируйте размер и цвет узлов сети с помощью панели стилей в левой панели управления.
  6. Анализ обогащения KEGG
    1. Откройте платформу Metascape (https://metascape.org/)27 . Вставьте текстовый список потенциальных терапевтических целей в диалоговое окно, а затем нажмите кнопку «Отправить ». Отметьте H. sapiens в обоих параметрах « Ввод как виды » и « Анализ как виды», а затем нажмите кнопку «Пользовательский анализ ». Выберите «Обогащение», отметьте только путь KEGG, а затем нажмите « Анализ обогащения». После того, как индикатор выполнения достигнет 100%, нажмите оранжевую кнопку на странице отчета об анализе , чтобы увидеть результаты обогащения.
    2. Нажмите « Все в одном ZIP-файле », чтобы загрузить результат обогащения, а затем откройте файл _ FINAL_GO.csv в папке Enrichment_GO , чтобы получить результат.
    3. Откройте программное обеспечение R (https://cran.r-project.org/). Введите install.package ("ggplot2") и library (ggplot2) в R для установки пакета ggplot2 R. Нажмите Enter , чтобы запустить программу визуализации KEGG.

2. Экспериментальная проверка

  1. Приготовление препарата
    ПРИМЕЧАНИЕ: Fritillaria thunbergii Miq и Trichosanthes kirilowii Maxim были приобретены в больнице Дунчжимэнь, связанной с Пекинским университетом китайской медицины.
    1. Смешайте 50 г Fritillaria thunbergii Miq и 50 г Trichosanthes kirilowii Maxim. Замочите смесь в 1 л дистиллированной воды на 20 мин, а затем отварите смесь при 100 °C при нормальном давлении в течение 1 ч.
    2. Отвар отфильтровать для получения фильтрата двойным слоем стерильной медицинской марли, а затем использовать фильтровальную бумагу 80 мкм для дальнейшей фильтрации экстракта. Повторите вышеописанную операцию три раза.
    3. Смешайте фильтрат вместе, чтобы получить примерно 1,2 л отвара. Поместите раствор в колбу роторного испарителя. Установите скорость вращения 50 об/мин при температуре 37 °C. Смешайте и конденсируйте отвары в экстракт во роторном испарителе в течение 6 часов, чтобы получить вязкую жидкость.
    4. Включите вакуумный механизм сублимационной сушки, чтобы предварительно охладить температуру до −40 °C. Перелейте полученный экстракт в лоток для материала и поместите его в холодную ловушку для замораживания.
    5. Когда температура холодной ловушки достигнет -50 °C и материал будет заморожен в течение 2 часов, перенесите замороженные материалы на сушильную стойку, помещенную в холодную ловушку. Включите вакуумный насос, чтобы начать процесс лиофилизации. Выньте лиофилизированный порошок и храните его в холодильнике при температуре -20 ° C для последующего использования.
  2. Культивирование клеток
    1. Сконфигурируйте полную среду DMEM с 89% основной средой DMEM, 10% эмбриональной бычьей сывороткой и 1% пенициллином-стрептомицином.
    2. После извлечения клеток А549 из жидкого азота инкубируйте клетки на водяной бане с температурой 37 °C и перемешивайте до тех пор, пока среда во флаконе не растает.
    3. Добавьте четырехкратный объем полной среды DMEM в расплавленные ячейки. Центрифугируйте клетки (4 °C, 679 x g, 5 мин) и выбросьте надосадочную жидкость.
    4. Ресуспендируют осажденные клетки 6 мл полной среды DMEM, помещают их в колбу для культивирования T25 и инкубируют колбу в клеточном инкубаторе при 37 ° C, 5% CO2.
  3. Определение жизнеспособности клеток
    1. Переваривают логарифмические клетки A549 фазы роста с 1 мл 0,25% трипсина в течение 1 мин при 37 ° C. Добавьте 1 мл полной среды DMEM, чтобы нейтрализовать трипсин, и осторожно продуйте его, чтобы способствовать слищению клеток. Центрифугируют смесь для получения клеточной гранулы (4 °C, 192 x g, 5 мин). Ресуспендируют полученные клетки с помощью полной среды DMEM.
    2. Добавьте клеточную суспензию в гемоцитометр и подсчитайте с помощью автоматического счетчика клеток. Разбавьте его до 5 x 104 клеток/мл, используя полную среду DMEM.
    3. Растворите 1 г водного экстракта Trichosanthes-Fritillaria thunbergii в 10 мл раствора PBS и профильтруйте-стерилизуйте его через фильтр 0,22 мкм. Разбавьте смесь до 90 мг/мл, 80 мг/мл, 70 мг/мл, 60 мг/мл, 50 мг/мл, 40 мг/мл, 30 мг/мл, 20 мг/мл и 10 мг/мл с использованием PBS.
    4. Наложите разбавленные ячейки на 96-луночные планшеты по 100 мкл на лунку. После адгезии клеток добавьте 1 мкл водных экстрактов Trichosanthes-Fritillaria thunbergii различных концентраций, чтобы отрегулировать концентрацию каждой лунки до 900 мкг/мл, 800 мкг/мл, 700 мкг/мл, 600 мкг/мл, 500 мкг/мл, 400 мкг/мл, 300 мкг/мл, 200 мкг/мл и 100 мкг/мл.
    5. Исходную среду отбрасывают через 24 ч культивирования и добавляют 100 мкл основной среды DMEM для дальнейшей инкубации в течение 2 ч при 37 °C, 5% CO2.
    6. После вышеуказанной обработки добавляют 20 мкл раствора МТС (таблица материалов) и инкубируют клетки еще 1 ч при 37 ° C, 5% CO2.
    7. Переложите инкубированную смесь на другую тарелку. Измерьте коэффициент поглощения (OD) на длине волны 490 нм с помощью считывателя микропланшетов. Рассчитайте жизнеспособность клеток по следующей формуле:
      Жизнеспособность (%) = 100 × (OD обработанного образца − OD среды)/(OD контрольного образца − OD среды).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальная концентрация, близкая к IC50, определяется как высокая доза. Концентрация, при которой начинает ингибироваться клеточная пролиферация, определяется как концентрация низкой дозы, а промежуточное значение определяется как концентрация средней дозы для последующих экспериментальных исследований. В этом исследовании 400 мкг / мл, 600 мкг / мл и 800 мкг / мл использовались в качестве низкой, средней и высокой доз.
  4. Медикаментозное вмешательство и сбор образцов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рост клеток был построен в зависимости от времени, чтобы определить логарифмическую фазу.
    1. Разбавьте логарифмические клетки фазы роста A549 до 5 x 10,5 клеток/мл. Добавьте 2 мл клеточной суспензии в 6-луночную пластину и выращивайте в течение 12 часов.
    2. Повторите шаг 2.3.3 для получения 80 мг / мл, 60 мг / мл и 40 мг / мл PBS разведения водного экстракта Trichosanthes-Fritillaria thunbergii. Добавьте 20 мкл раствора PBS, 20 мкл 40 мг/мл водного экстракта Trichosanthes-Fritillaria thunbergii, 20 мкл 60 мг/мл водного экстракта Trichosanthes-Fritillaria thunbergii и 20 мкл 80 мг/мл водного экстракта Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 80 мг/мл в пустую контрольную группу, группу с низкой концентрацией, группу со средней концентрацией и группу с высокой концентрацией, соответственно. Откажитесь от надосадочной жидкости через 24 часа после вмешательства и трижды очистите клетки с помощью PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации пустой контрольной группы, группы с низкой концентрацией, группы со средней концентрацией и группы с высокой концентрацией водного экстракта Trichosanthes-Fritillaria thunbergii составляли 0 мкг / мл, 400 мкг / мл, 600 мкг / мл и 800 мкг / мл соответственно.
    3. Добавьте 250 мкл буфера RIPA (содержащего 1% PMSF и 1% ингибитора фосфатазы) в каждую лунку и лизируйте клетки в течение 30 мин. Соберите лизат для центрифугирования (4 °C, 6,714 x g, 10 мин) и получите надосадочную жидкость.
  5. Вестерн-блоттинг
    1. Определите концентрацию белка в образцах методом BCA в соответствии с инструкциями производителя. Используйте буфер RIPA для регулировки концентрации каждого образца в соответствии с требованиями.
    2. Смешайте 40 мкл образца белка с 10 мкл 5-кратного загрузочного буфера и кипятите в течение 5 мин при 100 °C. Центрифугу (4 °С, 6,714 х г, 10 мин) смесь для получения надосадочной жидкости для последующих экспериментов.
    3. Изолируют белки с помощью гель-электрофореза с использованием вертикального электрофореза 120 В.
    4. Приготовьте электрический «сэндвич» (губка – фильтровальная бумага – гель – мембрана ПВДФ – фильтровальная бумага – губка). Замочите передаточный аппарат на ледяной бане и перенесите белок на мембраны PVDF при 70 В в течение 60 мин.
    5. Используйте 100 мл раствора TBST (0,05% [v/v] Tween-20, 10 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7,5) и 5 г сухого обезжиренного молока для формирования 5% молока. Предварительно разбавьте антитела AKT и p-AKT разбавителем антител в соотношении 1:1000.
    6. Заблокируйте мембрану PVDF в 5% сухом обезжиренном молоке на 1 ч при встряхивании. После блокировки выбросьте блокирующее молоко и добавьте разбавленное первичное антитело для ночной инкубации при 4 ° C.
    7. После удаления первичного антитела используйте раствор TBST для промывания мембраны PVDF пять раз по 5 минут каждый.
    8. Предварительно разбавьте вторичное антитело разбавителем антител в соотношении 1:5000. Добавьте вторичное антитело и инкубируйте при комнатной температуре (RT) в течение 1,5 часа. После удаления вторичного антитела используйте раствор TBST для промывки мембраны PVDF пять раз в течение 5 минут каждый.
    9. Обнаружение белка с помощью системы обнаружения хемилюминесценции.

3. Молекулярный докинг

  1. Откройте базу данных UniProt (https://www.uniprot.org)28. Введите целевые символы в поле поиска и нажмите кнопку ПОИСК . В подзаголовке « Структура » нажмите « Загрузить », чтобы увидеть 3D-структуры белковых мишеней.
  2. Откройте базу данных RCSB PDB (https://www.rcsb.org/pdb/home/sitemap.do)29. Введите название макромолекулы белка в поле поиска. Загрузите структуры белковых макромолекул в формате PDB.
  3. Загрузите установочный пакет программного обеспечения UCSF Chimera 1.16 (https://vina.scripps.edu/) и AutoDock Vina (https://vina.scripps.edu/). Установите и откройте программное обеспечение UCSF Chimera 1.16. Нажмите «Файл» > «Открыть », чтобы отобразить рецепторный белок.
  4. Нажмите «Инструменты» > «Редактирование структуры» > «Подготовка к доке» и установите флажок «Удалить растворитель», «Добавить водород» и «Добавить заряды» во всплывающем окне, чтобы удалить воду и добавить заряды гидрирования и баланса. Нажмите «Записать файл Mol2», чтобы сохранить рецепторный белок в формате mol2. Проделайте тот же шаг на лиганде.
  5. Нажмите «Файл», > «Открыть», чтобы отобразить лиганд формата mol2 в программном обеспечении UCSF Chimera 1.16. В разделе «Инструменты > анализа поверхности/связывания» > AutoDock Vina задайте для полосы рецептора имя белка рецептора, а для полосы «Лиганд» — имя лиганда. Введите значение в поле за «Центр » и « Размер », чтобы отрегулировать вновь разработанное пространство, что позволит полностью охватить лиганд и рецептор.
  6. Нажмите OK для виртуального скрининга молекулярного докинга, чтобы получить оптимальное место для связывания лиганда с рецептором. Запишите значение энергии связи в оптимальном положении.

4. Статистический анализ

  1. Откройте статистическое программное обеспечение SPSS 26.0. Нажмите « Файл» > «Импортировать данные » для загрузки данных.
  2. Представьте экспериментальные данные в виде среднего ± стандартного отклонения.
  3. Сравните несколько групп с помощью одностороннего ANOVA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: P < 0,05 считался статистически значимым в этой работе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В общей сложности был идентифицирован 31 активный компонент, связанный с Trichosanthes-Fritillaria thunbergii, в том числе 21 компонент Trichosanthes и 10 компонентов Fritillaria thunbergia, а также 144 соответствующие мишени. В целом, 9 049 и 67 генов, связанных с LUAD, были извлечены из базы данных GeneCards и базы данных OMIM соответственно. После удаления дублированных генов было идентифицировано 9 057 генов, связанных с LUAD. Для получения потенциальных терапевтических мишеней было проведено пересечение генов, связанных с LUAD, и мишеней, связанных с активным компонентом Trichosanthes-Fritillaria thunbergii. На рисунке 1А показана сеть взаимодействия лекарственного компонента-заболевания-мишени Trichosanthes-Fritillaria thunbergii против LUAD. В сети взаимодействия в первую десятку активных компонентов входили кемпферол, гидроксигенкванин, генистеин, диосметин и β-ситостерин, пальмитолеиновая кислота, манденол, гексадекановая кислота, карпроевая кислота и каприновая кислота, которые были идентифицированы как ключевые активные компоненты действия Trichosanthes-Fritillaria thunbergii при лечении LUAD (рис. 1B). Сеть ИПП включала 122 функциональных белка и 210 взаимосвязей, а результаты визуализации показаны на рисунке 2А. В первую десятку основных белков по степени (параметр, используемый для анализа визуализации в программном обеспечении Cytoscape) в порядке убывания вошли ESR1, VEGFA, PPARA, CYP3A4, AR, APP, FGF2, CREB1 и CYP1A1, которые в основном участвуют в неоваскуляризации, пролиферации клеток, апоптозе и транспорте клеточных мембран 30,31,32,33,34,35,36,37,38,39 (рис. 2В). Из 20 лучших путей, ранжированных KEGG, сигнальный путь PI3K/AKT 40, сигнальный путьRap1 41, сигнальный путь фосфолипазы D42 и сигнальный путь MAPK143 тесно связаны с раком легких, среди которых путь PI3K/AKT занял первое место и, таким образом, был использован для последующей верификации (рис. 3).

Эксперименты показали, что экстракты Trichosanthes-Fritillaria thunbergii в концентрациях более 400 мкг/мл могут ингибировать пролиферацию клеток, а ингибирующий эффект на клетки A549 в концентрациях до 800 мкг/мл был близок к полуингибирующей концентрации (IC50) (рис. 4). Таким образом, 400 мкг/мл, 600 мкг/мл и 800 мкг/мл использовались в качестве низкой, средней и высокой доз для последующих экспериментов. Вмешательство экстрактов Trichosanthes-Fritillaria thunbergii не вызывало существенных изменений экспрессии белка AKT в каждой группе; однако экспрессия p-AKT (Ser473) была ингибирована и проявляла дозозависимый эффект (рис. 5). Ключевые компоненты Trichosanthes-Fritillaria thunbergii при лечении LUAD были молекулярно состыкованы с ключевыми белками пути PI3K/AKT, и результаты показали, что энергии связывания диосметина и кемпферола с AKT1 были менее -7, что указывает на сильную связывающую активность44 (рис. 6).

Figure 1
Рисунок 1: Диаграмма сети «лекарственный компонент-болезнь-мишень». (A) Синий цвет обозначает болезнь; желтый цвет обозначает наркотик; Красным цветом обозначен компонент; Зеленым цветом обозначена цель. Сокращения: GL = Trichosanthes; ZBM = Fritillaria thunbergia; LUAD = аденокарцинома легкого. (B) Десять основных активных ингредиентов в сети, упорядоченных по степеням в порядке убывания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Сеть ИПП Trichosanthes-Fritillaria thunbergii при лечении LUAD. (А) Результаты визуализации сети ИЦП. Чем темнее узел, тем более центральным является белок в сети. (B) Десять основных целей в сети в разбивке по степеням. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Обогащение путем KEGG мишеней Trichosanthes-Fritillaria thunbergii против LUAD. (A) 20 лучших путей KEGG ранжированы в соответствии с P-значениями в порядке возрастания. (B) Карта сигнального пути PI3K/AKT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Влияние различных концентраций экстракта Trichosanthes-Fritillaria thunbergii на пролиферацию клеток A549 (n = 3). Экстракты Trichosanthes-Fritillaria thunbergii в концентрациях более 400 мкг/мл могут ингибировать пролиферацию клеток. Ингибирующее действие на клетки А549 в концентрациях до 800 мкг/мл было близко к полуингибирующей концентрации (IC50). Аббревиатура: GL-ZBM = Trichosanthes-Fritillaria thunbergii. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Влияние различных концентраций экстракта Trichosanthes-Fritillaria thunbergii на экспрессию белка AKT и уровни фосфорилирования (n = 3). Не было существенных изменений в экспрессии белка AKT в каждой группе, в то время как экспрессия белка p-AKT (Ser473) в группах со средней и высокой дозами была значительно снижена, и разница была статистически значимой по сравнению с контрольной группой (*P < 0,05 по сравнению с контрольной группой). Аббревиатура: GL-ZBM = Trichosanthes-Fritillaria thunbergii. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Молекулярная стыковка родственных компонентов с основными белками. (A) Тепловая карта энергии связывания ключевых компонентов Trichosanthes-Fritillaria thunbergii для лечения LUAD, молекулярно состыкованных с ключевыми белками пути PI3K/AKT. (B) Молекулярная диаграмма стыковки белков диосметина и AKT1. (C) Молекулярная диаграмма стыковки белков кемпферола и AKT1. Розовые линии представляют водородные связи, серые структуры представляют лекарственные композиции, а цветная структура представляет AKT1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Как правило, полное сетевое фармакологическое исследование включает в себя идентификацию активных компонентов из баз данных, приобретение мишеней, соответствующих активным компонентам и заболеваниям, построение сети «лекарственный компонент-болезнь-мишень» и прогнозирование основных мишеней и путей. Связь между активными компонентами и белками ядра (молекулярный докинг) предварительно предсказывается компьютерными технологиями, а окончательная проверка проводится с помощью эксперимента.

Подбор соответствующих баз данных является наиболее важной частью сетевой фармакологии, так как от этого зависит качество исследования. База данных HERB объединяет информацию из нескольких баз данных TCM, таких как Syμmap, TCMID, TCMSP и TCM-ID, и в настоящее время является наиболее полной базой данных TCM и ингредиентов. Таким образом, в этом исследовании база данных HERB была использована для скрининга активных компонентов19.

В этом исследовании с помощью соответствующих баз данных были идентифицированы 31 активный компонент и 144 мишени пересечения Trichosanthes-Fritillaria thunbergii при лечении LUAD. Построив сеть «лекарственный компонент-болезнь-мишень», мы исследовали десять ключевых активных компонентов с помощью топологического анализа. Основные мишени Trichosanthes-Fritillaria thunbergii при лечении LUAD были отсеяны с помощью анализа ИПП.

Согласно литературе, среди 20 основных путей из результатов KEGG сигнальный путь PI3K / AKT, сигнальный путь MAPK1, сигнальный путь Rap1 и сигнальный путь PPAR тесно связаны с опухолями 40,41,42. MAPK1, классический сигнальный путь, связанный с раком, является важным регулятором роста и дифференцировки клеток. При активации этот сигнальный путь приводит к неконтролируемой пролиферации клеток, удлинению клеточного цикла, возникновению и развитию опухоли45. Сигнальный путь Rap1 является важным регулятором сигнального пути NF-κB и сигнального пути MAPK1 и тесно связан с клеточной адгезией при раке легких46. Кроме того, было подтверждено, что ингибирование сигнального пути Rap1 может улучшить метастазирование опухоли при карциномелегких 47. Сигнальный путь PPAR связан с пролиферацией клеток, энергетическим гомеостазом, онкогенезом и метаболическими нарушениями48. Исследования подтвердили его функцию в стимулировании ангиогенеза опухоли и роста опухоли49.

Сигнальный путь PI3K/AKT в основном влияет на метаболизм, пролиферацию, апоптоз и васкуляризацию опухолей посредством фосфорилирования и активации AKT. Предыдущие исследования показали, что сигнальный путь PI3K/AKT играет регуляторную роль в сигнальном пути MAPK1, сигнальном пути Rap1 и сигнальном пути PPAR50,51,52. Более того, результаты прогнозирования KEGG показали, что сигнальный путь PI3K/AKT наиболее тесно связан с действием Trichosanthes-Fritillaria thunbergii против LUAD, поэтому он был выбран для последующей экспериментальной проверки.

Предсказанные PPI основные мишени, VEGFA и CREB1 в сигнальном пути PI3K/AKT, а также ключевые белки PI3K и AKT1 в сигнальном пути PI3K/AKT были включены в молекулярный докинг. В предыдущем исследовании энергия связи стыковки менее −7 считалась значимой44. Результаты этого исследования показали, что энергия связывания кемпферола и диосметина с AKT1 превысила этот порог, предполагая, что влияние этих двух компонентов на AKT может быть ключом к действию Trichosanthes-Fritillaria thunbergii против LUAD.

В ходе дальнейшей экспериментальной проверки мы исследовали влияние экстракта Trichosanthes-Fritillaria thunbergii на уровень фосфорилирования AKT. Результаты показали, что различные концентрации экстракта Trichosanthes-Fritillaria thunbergii не оказывали существенного влияния на экспрессию белка AKT, но экстракт Trichosanthes-Fritillaria thunbergii мог значительно ингибировать фосфорилирование белка AKT дозозависимым образом. Эти результаты свидетельствуют о том, что ингибирование пути PI3K/AKT является ключевым механизмом действия Trichosanthes-Fritillaria thunbergii против LUAD.

В заключение, благодаря сетевой фармакологии и экспериментальной проверке это исследование подтвердило, что сигнальный путь PI3K / AKT играет жизненно важную роль в действии Trichosanthes-Fritillaria thunbergii при лечении LUAD.

В этом исследовании все же есть некоторые недостатки. Исследование включало только активные компоненты с высокой биодоступностью без обсуждения возможной биотрансформации активных молекул в толстой кишке, клетках кишечника и печени, что не является достаточно полным. Кроме того, влияние Trichosanthes-Fritillaria thunbergii на пролиферацию и путь PI3K/AKT клеток аденокарциномы легкого было экспериментально подтверждено только in vitro. Это исследование обеспечивает теоретическую основу для разработки новых лекарств и расширения клинического применения. В будущем будут проведены дальнейшие экспериментальные проверки этих результатов прогнозирования для поддержки оценок потенциальных клинических применений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Программой обучения инновациям Пекинского университета китайской медицины (No: 202110026036).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco R001100
A549 cell line Procell CL-0016
AKT antibody CST 4691S
BCA Protein Assay Kit Solarbio PC0020
Chemiluminescence detection system Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory ChemiScope 6100
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Solarbio 11995
Enhanced chemiluminescence (ECL) kit  ABclonal RM00021
Fetal bovine serum ScienCell 0025
HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) ABclonal AS014
MTS assay kit Promega G3580
p-AKT antibody CST 6040S
Penicillin streptomycin Gibco C14-15070-063
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Solarbio P0100
Phosphatase inhibitor Beyotime P1081
Phosphate buffered saline (PBS) Solarbio P1020
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes Millipore ISEQ00010
RIPA lysis solution Solarbio R0010
Rotary evaporator Shanghai Yarong Biochemical Instrument Factory RE52CS-1
Vacuum freeze-drying mechanism Ningbo Scientz Biotechnology SCIENTZ-10
β-Actin antibody ABclonal AC026

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thai, A. A., Solomon, B. J., Sequist, L. V., Gainor, J. F., Heist, R. S. Lung cancer. The Lancet. 398 (10299), 535-554 (2021).
  2. Sinha, A., et al. Early-stage lung adenocarcinoma MDM2 genomic amplification predicts clinical outcome and response to targeted therapy. Cancers. 14 (3), 708 (2022).
  3. Howlader, N., et al. The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality. The New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).
  4. Hirsch, F. R., et al. Lung cancer: Current therapies and new targeted treatments. The Lancet. 389 (10066), 299-311 (2017).
  5. Liu, J., et al. Comprehensive treatment with Chinese medicine in patients with advanced non-small cell lung cancer: A multicenter, prospective, cohort study. Chinese Journal of Integrative Medicine. 23 (10), 733-739 (2016).
  6. Xiao, Z. W., et al. Comprehensive TCM treatments combined with chemotherapy for advanced non-small cell lung cancer: A randomized, controlled trial. Medicine. 100 (18), 25690 (2021).
  7. Li, Y., et al. Effectiveness of traditional Chinese medicine on chemoradiotherapy induced leukaemia in patients with lung cancer: A meta-analysis. Journal of Traditional Chinese Medicine. 38 (5), 661-667 (2018).
  8. Yuan, F., et al. Therapeutic effect and apoptosis mechanism of lung-tonifying and expectorant decoction on lung cancer rats with Qi deficiency and blood stasis. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 8 (11), 983-988 (2015).
  9. Zhang, Y. L., Liang, Y. E., He, C. W. Anticancer activities and mechanisms of heat-clearing and detoxicating traditional Chinese herbal medicine. Chinese Medicine. 12, 20 (2017).
  10. Wang, T. B., et al. Exploring the rules of application of RONG Yuan-ming in the treatment of non-small cell lung cancer. Guiding Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 25 (14), 22-25 (2019).
  11. Chen, T. T., Wang, Y., Tian, T. Medication regularity and mechanism of traditional Chinese medicine in treating lung cancer. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 24 (11), 206-210 (2018).
  12. Shen, C. J. Analysis of the rule of Chinese medicine in treating lung cancer. Journal of Shandong University of Traditional Chinese Medicine. 35 (2), 127-129 (2011).
  13. Yang, X. Y., et al. Evidence-based complementary and alternative medicine bioinformatics approach through network pharmacology and molecular docking to determine the molecular mechanisms of Erjing pill in Alzheimer's disease. Experimental and Therapeutic Medicine. 22 (5), 1252 (2021).
  14. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of Rhizoma Drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design Development and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
  15. Chen, G. Y., et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of Gubitong recipe in the treatment of osteoarthritis. Computational and Mathematical Methods in Medicine. 2022, 7858925 (2022).
  16. Xie, G. G., et al. A network pharmacology analysis to explore the effect of Astragali Radix-Radix Angelica Sinensis on traumatic brain injury. BioMed Research International. 2018, 3951783 (2018).
  17. Chen, G. Y., et al. Prediction of Rhizoma Drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 5233462 (2021).
  18. World Federation of Chinese Medicine Societies. Network pharmacology evaluation methodology guidance. World Chinese Medicine. 16 (4), 527-532 (2021).
  19. Fang, S. S., et al. A high-throughput experiment- and reference-guided database of traditional Chinese medicine. Nucleic Acids Research. 49, 1197-1206 (2021).
  20. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology-based strategy to investigate the mechanisms of Cibotium barometz in treating osteoarthritis. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2022, 1826299 (2022).
  21. Yu, J. H., et al. ZiYinHuaTan recipe inhibits cell proliferation and promotes apoptosis in gastric cancer by suppressing PI3K/AKT pathway. BioMed Research International. 2020, 2018162 (2020).
  22. Daina, A., Michielin, O., Zoete, V. SwissADME: A free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Scientific Reports. 7, 42717 (2017).
  23. Keiser, M. J., et al. Relating protein pharmacology by ligand chemistry. Nature Biotechnology. 25 (2), 197-206 (2007).
  24. Safran, M., et al. GeneCards Version 3: The human gene integrator. Database. 2010, (2010).
  25. Amberger, J. S., Hamosh, A. Searching Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM): A knowledgebase of human genes and genetic phenotypes. Current Protocols in Bioinformatics. 58, 1-12 (2017).
  26. Mering, C. V., et al. STRING: Known and predicted protein-protein associations, integrated and transferred across organisms. Nucleic Acids Research. 33, 433-437 (2005).
  27. Zhou, Y. Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10, 1523 (2019).
  28. Pundir, S., et al. UniProt protein knowledgebase. Methods in Molecular Biology. 1558, 41-55 (2017).
  29. Burley, S. K., et al. Protein data bank (PDB): The single global macromolecular structure archive. Methods in Molecular Biology. 1607, 627-641 (2017).
  30. Welsh, L. C., Welsh, M. VEGFA and tumour angiogenesis. Journal of Internal Medicine. 273 (2), 114-127 (2013).
  31. Hsu, L. H., Chu, N. M., Kao, S. H. Estrogen, estrogen receptor and lung cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1713 (2017).
  32. Atmaca, A., et al. SNAI2/SLUG and estrogen receptor mRNA expression are inversely correlated and prognostic of patient outcome in metastatic non-small cell lung cancer. BMC Cancer. 15, 300 (2015).
  33. Lakshmi, S. P., Reddy, A. T., Banno, A., Reddy, R. C. PPAR agonists for the prevention and treatment of lung cancer. PPAR Research. 2017, 8252796 (2017).
  34. Oguro, A., Sakamoto, K., Funae, Y., Imaoka, S. Overexpression of CYP3A4, but not of CYP2D6, promotes hypoxic response and cell growth of Hep3B cells. Drug Metabolism and Pharmacokinetics. 26 (4), 407-415 (2011).
  35. Jamroze, A., Chatta, G., Tang, D. G. Androgen receptor (AR) heterogeneity in prostate cancer and therapy resistance. Cancer Letters. 518, 1-9 (2021).
  36. Wu, Y. I., et al. Regulation of global gene expression and cell proliferation by APP. Scientific Reports. 6, 22460 (2016).
  37. Sedlář, A., et al. Growth factors VEGF-A 165 and FGF-2 as multifunctional biomolecules governing cell adhesion and proliferation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1843 (2021).
  38. Guo, L. H., Yin, M., Wang, Y. X. CREB1, a direct target of miR-122, promotes cell proliferation and invasion in bladder cancer. Oncology Letters. 16 (3), 3842-3848 (2018).
  39. Wang, D. D., et al. Induction of CYP1A1 increases gefitinib-induced oxidative stress and apoptosis in A549 cells. Toxicology In Vitro. 44, 36-43 (2017).
  40. Tan, A. C. Targeting the PI3K/Akt/mTOR pathway in non-small cell lung cancer (NSCLC). Thoracic Cancer. 11 (3), 511-518 (2020).
  41. Jin, X., et al. RBM10 inhibits cell proliferation of lung adenocarcinoma via RAP1/AKT/CREB signalling pathway. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 3897-3904 (2019).
  42. Henkels, K. M., et al. Phospholipase D (PLD) drives cell invasion, tumor growth and metastasis in a human breast cancer xenograph model. Oncogene. 32 (49), 5551-5562 (2013).
  43. Zhang, Z. Y., et al. CircRNA_101237 promotes NSCLC progression via the miRNA-490-3p/MAPK1 axis. Scientific Reports. 10, 490-493 (2020).
  44. Gao, T. X., et al. Exploring the mechanism of Fu-Zi Decoction in treatment of chronic heart failure based on network pharmacology and molecular docking technology. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences. 30 (09), 705-715 (2021).
  45. Wang, B., et al. PP4C facilitates lung cancer proliferation and inhibits apoptosis via activating MAPK/ERK pathway. Pathology, Research and Practice. 216 (5), 152910 (2020).
  46. Moon, M. Y., et al. Rap1 regulates hepatic stellate cell migration through the modulation of RhoA activity in response to TGF-β1. International Journal of Molecular Medicine. 44 (2), 491-502 (2019).
  47. Kan, J., et al. He-Chan Pian inhibits the metastasis of non-small cell lung cancer via the miR-205-5p-mediated regulation of the GREM1/Rap1 signaling pathway. Phytomedicine. 94, 153821 (2022).
  48. Sidrat, T., et al. Role of Wnt signaling during in-vitro bovine blastocyst development and maturation in synergism with PPARδ signaling. Cells. 9 (4), 923 (2020).
  49. Wagner, N., Wagner, K. D. PPAR beta/delta and the hallmarks of cancer. Cells. 9 (5), 1133 (2020).
  50. Miriam, M., et al. PI3K/AKT signaling pathway and cancer: An updated review. Annals of Medicine. 46 (6), 372-383 (2014).
  51. Ma, X. L., et al. CD73 promotes hepatocellular carcinoma progression and metastasis via activating PI3K/AKT signaling by inducing Rap1-mediated membrane localization of P110β and predicts poor prognosis. Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 37 (2019).
  52. Li, T., et al. Pomegranate flower extract bidirectionally regulates the proliferation, differentiation and apoptosis of 3T3-L1 cells through regulation of PPARγ expression mediated by PI3K-AKT signaling pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 131, 110769 (2020).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 193 Аденокарцинома легкого сетевая фармакология Trichosanthes kirilowii Maxim Fritillaria thunbergii Miq сигнальный путь PI3K/AKT
Прогнозирование сетевой фармакологии и экспериментальная проверка механизма действия <em>Trichosanthes-Fritillaria</em> <em>thunbergii</em> против аденокарциномы легкого
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, X. y., Yang, Y. y., Feng, J.… More

Zhao, X. y., Yang, Y. y., Feng, J. l., Feng, C. l. Network Pharmacology Prediction and Experimental Validation of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii Action Mechanism Against Lung Adenocarcinoma. J. Vis. Exp. (193), e64847, doi:10.3791/64847 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter