Demonstração do Ensaio de Fibras de DNA para Investigação de Danos ao DNA e Dinâmica de Reparo Induzidos por Nanopartículas

Summary

A metodologia auxilia na análise da variação na dinâmica de replicação do DNA na presença de nanopartículas. Diferentes metodologias podem ser adotadas com base no nível de citotoxicidade do material de interesse. Além disso, uma descrição da análise de imagem é fornecida para ajudar na análise de fibras de DNA.

Abstract

A exposição a nanomateriais pode causar estresse de replicação e instabilidade genômica nas células. O grau de instabilidade depende da química, tamanho e concentração dos nanomateriais, do tempo de exposição e do tipo de célula exposta. Vários métodos estabelecidos têm sido utilizados para elucidar como agentes endógenos/exógenos afetam a replicação global. No entanto, ensaios em nível de replicon, como o ensaio de fibra de DNA, são imperativos para entender como esses agentes influenciam o início da replicação, terminações e progressão da bifurcação de replicação. Saber disso permite entender melhor como os nanomateriais aumentam as chances de fixação de mutações e instabilidade genômica. Usamos macrófagos RAW 264.7 como células modelo para estudar a dinâmica de replicação sob exposição a nanopartículas de óxido de grafeno. Aqui, demonstramos o protocolo básico para o ensaio de fibras de DNA, que inclui marcação de pulso com análogos de nucleotídeos, lise celular, disseminação das fibras de DNA marcadas com pulso em lâminas, imunomarcação fluorescente dos análogos de nucleotídeos dentro das fibras de DNA, imagem dos intermediários de replicação dentro das fibras de DNA usando microscopia confocal e análise intermediária de replicação utilizando um software de pontuação e análise assistida por computador (CASA).

Introduction

Durante cada ciclo celular, a replicação do DNA garante a duplicação precisa do genoma¹. A replicação cromossômica eucariótica depende essencialmente de três fatores: o momento do disparo de múltiplas origens de replicação, a velocidade dos garfos que emergem das origens disparadas e o término do processo de replicação quando dois garfos de replicação de origens adjacentes se encontram². Para a transmissão de alta fidelidade da informação genética para as células filhas, bem como a preservação da integridade genética, a replicação precisa do DNA é crucial. Agentes que se desenvolvem a partir do metabolismo regular ou são devidos a materiais ambientais artificiais ou naturais estão constantemente atacando o genoma. Esses agentes endógenos e exógenos fazem com que os garfos de replicação diminuam ou parem devido ao encontro de danos no DNA causados por esses agentes, e os garfos temporariamente desacelerando ou parando em resposta a essas dificuldades é denominado estresse de replicação³. Em resposta ao estresse de replicação, as células desenvolveram várias vias moleculares que mantêm a estabilidade dos garfos de replicação perturbados e permitem que eles reiniciem⁴. Em termos de estabilidade genética, sobrevivência celular e doença humana, esses mecanismos de resposta ao estresse de replicação têm emergido como os fatores-chave para manter um genoma saudável, garantir a sobrevivência celular e diminuir a probabilidade de formação de doenças⁵.

Um dos agentes exógenos capazes de produzir estresse de replicação são as nanopartículas. Nanopartículas são partículas que variam em tamanho de 1 nm a 100 nm⁶. Devido às suas altas áreas superficiais, formas distintas e propriedades químicas únicas, as nanopartículas são utilizadas em várias aplicações médicas, farmacêuticas, ambientais e industriais ^7,8. Embora as nanopartículas tenham muitos benefícios potenciais, algumas delas (devido à sua natureza hereditária ou longevidade) podem se tornar tóxicas. As nanopartículas também podem se formar devido ao desgaste natural dos implantes médicos e serem liberadas na região periprotética ^9,10.

Devido à exposição dos seres humanos a uma miríade de nanopartículas produzidas para diversas aplicações, a pesquisa na área de toxicidade de nanopartículas tem aumentado enormemente nos últimos 10 anos¹¹. Embora esses esforços de pesquisa tenham revelado informações em abundância sobre a ameaça potencial que as nanopartículas representam para a saúde humana, o conhecimento sobre o potencial das nanopartículas para causar genotoxicidade ainda é limitado. O que foi descoberto até agora é que essas nanopartículas podem interagir fisicamente com o DNA, promover danos ao DNA e danificar ou interferir com as proteínas responsáveis por reparar ou replicar o DNA¹². Para detectar como eles interferem na replicação do DNA, o penteamento de fibras de DNA, a síntese de DNA radiorresistente (SDR) e a análise de fibras de DNA são tipicamente usados^13,14,15,16.

O método de pentear de fibras de DNA é flexível e fornece informações sobre a dinâmica da bifurcação de replicação no nível de molécula única¹⁷. Em essência, uma lamínula salinizada é suavemente retirada da solução de DNA assim que o DNA termina de se ligar a ela. As moléculas de DNA são retizadas e alinhadas pelo menisco da solução. A homogeneidade, o espaçamento e o alinhamento das fibras de DNA suportam medições precisas e confiáveis do comprimento do trato das fibras. Ao ajustar a duração e a sequência dos tratamentos e dos medicamentos usados para causar estresse ou danos, muitos aspectos do avanço do garfo podem ser monitorados usando este aplicativo. Nesse método, utiliza-se um sistema de dupla rotulagem, por meio do qual se avalia a velocidade e a progressão da bifurcação de replicação^17,18. Por outro lado, a eletroforese em gel 2D aproveita o fato de que, na eletroforese em gel de agarose, estruturas ramificadas de DNA viajam mais lentamente do que moléculas lineares de DNA de mesma massa, permitindo a separação limpa das duas em uma corrida 2D. De fato, este método é investigado para segregar moléculas de DNA com base em sua massa na primeira corrida e com base em sua forma na segunda corrida ortogonal. Após a fragmentação do DNA genômico, os intermediários incomuns de replicação e recombinação desenvolvem uma forma ramificada, podendo ser distinguidos das moléculas lineares mais comuns no gel 2D¹⁹.

O método RDS é usado para determinar como a síntese global de DNA é afetada. Nesse método, o grau de inibição da replicação global é determinado comparando-se a quantidade de nucleotídeos radioativamente marcados incorporados, como a [14C] timidina, em células não tratadas versus tratadas^14,20. A diferença percentual na marcação radioativa entre as células não tratadas e tratadas representa o grau em que o agente prejudicial ao DNA afeta a síntese de DNA. Semelhante a este, outro método utiliza a capacidade das células de integrar análogos de nucleotídeos como BrdU (5-bromo-2′-desoxiuridina) para citometria de fluxo para medir as taxas globais de síntese de DNA^21,22. Embora esses métodos demonstrem como os agentes prejudiciais ao DNA afetam a síntese global de DNA, eles não mostram como os replicons individuais são afetados. De fato, ensaios em nível de replicon são imperativos para entender melhor o início e a extensão da instabilidade genômica em caso de exposição a partículas tóxicas (nanomateriais). A autorradiografia por fibras de DNA e a microscopia eletrônica são alguns métodos utilizados para sua determinação23,24,25,26.

Os conceitos de bolhas de replicação e replicação bidirecional a partir de fontes desigualmente espaçadas foram primeiramente desenvolvidos utilizando testes de molécula única, como microscopia eletrônica e autorradiografia por fibras de^DNA27,28. A observação direta de intermediários de replicação ramificada em moléculas específicas dispersas através de uma grade revestida de carbono é grandemente facilitada pela microscopia eletrônica. Esse método, que ainda hoje é usado para rastrear desvios patológicos em bifurcações de replicação, foi utilizado para localizar a primeira origem eucariótica da replicação do^DNA28. A autorradiografia por fibras está centrada no conceito de identificação autorradiográfica de áreas recém-replicadas e marcação de pulso de cromossomos com timidina tritiada. A primeira avaliação quantitativa das densidades de origem e das taxas de replicação em sequências genômicas de metazoários foi possível pela autorradiografia de fibras de^DNA29.

Atualmente, os métodos de fluorografia de fibras têm tomado o lugar da autorradiografia, principalmente porque a fluorografia de fibras é muito mais rápida do que a autorradiografia. Na fluorografia das fibras, dois derivados nucleotídicos halogenados, como bromo- (Br), cloro- (Cl) ou iododesoxiuridina (IdU), são incorporados sequencialmente ao DNA recém-replicado e então identificados por imunofluorescência indireta usando anticorpos³⁰. A visualização microscópica do DNA nascente que incorporou um ou ambos os análogos é possível pela imunomarcação de um dos análogos em uma cor e o outro análogo em uma cor diferente (por exemplo, imunomarcação de DNA nascente com vermelho IdU incorporado e verde CldU incorporado) (Figura 1)²¹. Muitos tipos diferentes de intermediários de replicação podem ser identificados por análise de fibras de DNA. Os mais comumente estudados são garfos alongadores individuais, iniciações e terminações. Garfos alongadores individuais têm um padrão de replicação de vermelho seguido de verde (vermelho-verde; Figura 2A). ¹³ Os comprimentos desses intermediários são frequentemente usados para medir a velocidade da bifurcação (isto é, comprimento da bifurcação/tempo de pulso) ou a degradação exonucleolítica do DNA nascente através do encurtamento da pista (Figura 2E)^30,31,32. Em um estudo realizado por Mimitou et al., verificou-se que, após exposição prolongada à hidroxiureia, um veneno de replicação que causa quebras de fita dupla no DNA, RE11 foi recrutado³³. A MRE11 é uma exonuclease conhecida por sua atividade de exonuclease 3′-5′, sendo capaz de cortar as extremidades do DNA para reparo. Portanto, quando expostos a agentes tóxicos, pode-se observar degradação exonucleolítica do DNA nascente, que é o encurtamento da fita de DNA devido à exposição a um agente lesivo ao DNA³⁴.

Quebras de bifurcação de replicação provocadas por obstruções físicas (complexos DNA-proteína ou lesões de DNA), impedimentos químicos ou mutações podem interromper a replicação e necessitar de recombinação homóloga para reiniciá-la. Isso é conhecido como progressão de garfo prejudicada. Numerosas investigações in vitro e in vivo têm indicado que a transcrição pode, ocasionalmente, impedir o avanço da bifurcação de replicação dessa maneira³⁵.

As iniciações são origens de replicação que iniciam e disparam durante o primeiro ou segundo pulso. As origens que disparam durante o primeiro pulso e têm bifurcações de replicação que continuam ativas têm um padrão verde-vermelho-verde (Figura 2B, abaixo). As origens que se iniciam durante o segundo pulso têm um padrão somente verde (Figura 2B, superior) e às vezes são chamadas de origens recém-iniciadas, de modo que essas origens podem ser diferenciadas daquelas que se iniciam durante o primeiro pulso. A comparação das porcentagens relativas de origens recém-queimadas entre duas condições experimentais permite entender como uma célula responde a um agente prejudicial ao DNA ou à presença ou ausência de uma proteína. As terminações são criadas quando duas bifurcações de replicação de replicons adjacentes se fundem e têm um padrão vermelho-verde-vermelho (Figura 2D)³⁰.

Com base nos fatos descritos acima, a análise de fibras de DNA é atualmente considerada um método preferencial para estudar a variação na dinâmica de replicação do DNA causada por agentes tóxicos como nanomateriais. Os pesquisadores agora têm uma boa compreensão e conhecimento da dinâmica da replicação do DNA em todo o genoma em eucariotos, tanto quantitativa quanto qualitativamente, devido à descoberta dessa tecnologia³⁶. Com base nas variáveis de desfecho, diversas metodologias podem ser adotadas. Alguns exemplos de métodos para estudar as variações nos danos ao DNA induzidos por agentes externos/nanopartículas são mostrados na Figura 3. O objetivo geral do método de análise de fibras de DNA descrito neste estudo é determinar como as nanopartículas impactam o processo de replicação in vitro e como elas afetam diferencialmente vários tecidos.

Protocol

1. Preparação de anticorpos e tampão Preparar a solução primária de anticorpos, camundongo anti-BrdU em uma diluição de 1:300 em BSA a 5% e anti-BrdU de rato a uma diluição de 1:500 em BSA a 5%. Preparar a solução de anticorpos secundários, alexafluor 594 coelho anti-rato numa diluição de 1:300 em BSA a 5% e alexafluor 488 anti-rato de frango numa diluição de 1:500 em BSA a 5%. Preparar a solução de anticorpos terciários, alexafluor 594 cabra anti-coelho …

Representative Results

Depois de obter imagens suficientes (de 20 a 100 imagens por condição), os intermediários de replicação precisam ser identificados, medidos e contados. Seja analisando as fibras manualmente ou automaticamente por meio de um programa38, é necessário definir claramente quais características uma fibra deve ter para que possa ser contada ou pontuada (ou não contada ou medida)39. Por exemplo, as seguintes questões podem ser consideradas. (1) Deve-se medir e co…

Discussion

Discutimos aqui um método para auxiliar na análise da variação na dinâmica de replicação do DNA na presença de nanopartículas através do ensaio de fibras de DNA. As principais etapas críticas envolvidas no ensaio padrão estão descritas no protocolo (passo 2.2.2 e passo 3.1.3). É sempre recomendado usar uma área com exposição limitada à luz aérea e fluxo de ar constante para evitar quebras de DNA induzidas pela luz nas lâminas, bem como para aumentar a reprodutibilidade. É necessária uma atenção cu…

Materials

24 well plate	Fisher brand	FB012929
Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092
Alexa flour 594 goat anti-rabbit	Invitrogen	A11037
Alexa fluor 488 chicken anti-rat	Invitrogen	A21470
Alexa fluor 488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse	Invitrogen	A11062
BSA	Sigma Aldrich	A2153
CldU	Sigma Aldrich	50-90-8
Coverslips (22 x 50 mm)	Fisher brand	12-545-EP
EDTA	Fisher Scientific	15575020
Frosted Microscope Slides	Fisher brand	12-550-11
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	320331
IdU	Sigma Aldrich	54-42-2
Methanol	Fisher Scientific	A454-4
Mouse Anti-BrdU	BD Biosciences	347580
Phosphate Buffer Saline	Gibco	10010072
Rat anti-BrdU	Abcam	BU1–75(ICR1)
Raw 264.5 macrophage cells	ATCC	TIB-71
SDS	Sigma Aldrich	L3771
Silane-Prep slides	Sigma Aldrich	S4651-72EA
Superfrost gold plus slides	Fischer scientific	22-035813
Tris pH 7.4	Sigma Aldrich	77861
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416