BS3 Ensayo de reticulación química: evaluación del efecto del estrés crónico en la superficie celularPresentación del receptor GABA A en el cerebro de roedores
Summary
El ensayo de reticulación química BS3 revela una expresión reducida del receptor GABAA en la superficie celular en cerebros de ratones en condiciones de estrés psicosocial crónico.
Abstract
La ansiedad es un estado de emoción que afecta de manera variable los comportamientos de los animales, incluidas las funciones cognitivas. Los signos conductuales de ansiedad se observan en todo el reino animal y pueden reconocerse como respuestas adaptativas o desadaptativas a una amplia gama de modalidades de estrés. Los roedores proporcionan un modelo experimental probado para estudios traslacionales que abordan los mecanismos integradores de la ansiedad a nivel molecular, celular y de circuito. En particular, el paradigma del estrés psicosocial crónico provoca respuestas desadaptativas que imitan fenotipos conductuales similares a la ansiedad / depresivos que son análogos entre humanos y roedores. Si bien estudios previos muestran efectos significativos del estrés crónico en el contenido de los neurotransmisores en el cerebro, el efecto del estrés en los niveles de receptores de neurotransmisores está poco estudiado. En este artículo, presentamos un método experimental para cuantificar los niveles de superficie neuronal de los receptores de neurotransmisores en ratones bajo estrés crónico, especialmente centrándonos en los receptores de ácido gamma-aminobutírico (GABA), que están implicados en la regulación de la emoción y la cognición. Usando el reticulante químico irreversible impermeable a la membrana, bissulfosuccinimidyl suberate (BS3), mostramos que el estrés crónico regula significativamente a la baja la disponibilidad superficial de los receptores GABAA en la corteza prefrontal. Los niveles de superficie neuronal de los receptores GABAA son el proceso limitante de la velocidad para la neurotransmisión de GABA y, por lo tanto, podrían usarse como un marcador molecular o un proxy del grado de fenotipos similares a la ansiedad / depresivos en modelos animales experimentales. Este enfoque de reticulación es aplicable a una variedad de sistemas receptores para neurotransmisores o neuromoduladores expresados en cualquier región del cerebro y se espera que contribuya a una comprensión más profunda de los mecanismos subyacentes a la emoción y la cognición.
Introduction
Los receptores de neurotransmisores se localizan en la superficie de la membrana plasmática neuronal o intracelularmente en las endomembranas (por ejemplo, el endosoma, el retículo endoplásmico [RE] o el aparato trans-Golgi) y se desplazan dinámicamente entre estos dos compartimentos dependiendo de los estados fisiológicos intrínsecos en las neuronas o en respuesta a las actividades de la red neuronal extrínseca 1,2. Dado que los neurotransmisores recién secretados provocan sus funciones fisiológicas principalmente a través del conjunto de receptores localizados en la superficie, los niveles de receptores de superficie para un neurotransmisor dado son uno de los determinantes críticos de su capacidad de señalización dentro del circuito neuronal3.
Existen varios métodos disponibles para monitorizar los niveles de receptores de superficie en neuronas cultivadas, incluyendo el ensayo de biotinilación superficial4, el ensayo de inmunofluorescencia con un anticuerpo específico en condiciones no permeabilizadas5, o el uso de un transgén receptor genéticamente fusionado con un indicador óptico fluorescente sensible al pH (por ejemplo, pHluorin)6. Por el contrario, estos enfoques son limitados o poco prácticos cuando se evalúan los niveles de receptores de superficie in vivo. Por ejemplo, el procedimiento de biotinilación de superficie puede no ser práctico para procesar grandes cantidades y números de muestras de tejidos cerebrales in vivo debido a su precio relativamente alto y los pasos posteriores necesarios para purificar las proteínas biotiniladas en perlas conjugadas con avidina. Para las neuronas integradas en la arquitectura cerebral tridimensional, la baja accesibilidad de anticuerpos o las dificultades en la cuantificación basada en microscopios pueden plantear una limitación significativa para evaluar los niveles de receptores de superficie in vivo. Para visualizar la distribución de los receptores de neurotransmisores en cerebros intactos, se podrían utilizar métodos no invasivos, como la tomografía por emisión de positrones, para medir la ocupación del receptor y estimar los niveles de receptores de superficie7. Sin embargo, este enfoque se basa críticamente en la disponibilidad de ligandos de radio específicos, equipos costosos y experiencia especial, lo que lo hace menos accesible para el uso rutinario de la mayoría de los investigadores.
Aquí, describimos un método simple y versátil para medir los niveles de receptores de superficie en cerebros de animales experimentales ex vivo utilizando un reticulante químico soluble en agua e impermeable a la membrana, bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3)8,9. BS3 se dirige a aminas primarias en la cadena lateral de residuos de lisina y puede reticular covalentemente proteínas muy cercanas entre sí. Cuando los cortes de cerebro se preparan recién a partir de una región de interés y se incuban en un tampón que contiene BS3, los receptores de la superficie celular se entrecruzan con proteínas vecinas y, por lo tanto, se transforman en especies de mayor peso molecular, mientras que los receptores asociados a la endomembrana intracelular permanecen sin modificar. Por lo tanto, los grupos de receptores superficiales e intracelulares pueden separarse mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y cuantificarse mediante Western blot utilizando anticuerpos específicos para el receptor a estudiar.
El estrés crónico leve impredecible (EMU) es un paradigma experimental bien establecido para inducir estrés psicosocial crónico en roedores10. UCMS provoca fenotipos conductuales similares a la ansiedad / depresivos y déficits cognitivos a través de la modulación de una serie de sistemas de neurotransmisores, incluyendo GABA y sus receptores10,11. En particular, el receptor GABA A que contiene la subunidad α5 (α5-GABAA R) está implicado en la regulación de la memoria y las funciones cognitivas12,13, lo que sugiere la posible participación de funciones alteradas de esta subunidad en los déficits cognitivos inducidos por UCMS. En este protocolo, utilizamos el ensayo de reticulación BS3 para cuantificar los niveles de α5-GABAAR expresado en la superficie en la corteza prefrontal de ratones expuestos a UCMS en comparación con ratones de control no estresados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque el impacto del estrés psicosocial crónico en los comportamientos (es decir, la emocionalidad y los déficits cognitivos) y los cambios moleculares (es decir, la expresión reducida de los genes GABAérgicos y los déficits que acompañan a la neurotransmisión GABAérgica) están bien documentados10, los mecanismos subyacentes a tales déficits necesitan más investigación. En particular, dado el reciente estudio que muestra que el estrés crónico afecta significativamente el proteoma n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al personal de la instalación de animales CAMH por cuidar a los animales durante la duración del estudio. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud (CIHR Project Grant # 470458 to T.T.), el Discovery Fund del CAMH (a T.P.), la Alianza Nacional para la Investigación sobre la Esquizofrenia y la Depresión (premio NARSAD # 25637 a E.S.) y el Instituto de Investigación de Salud Mental de la Familia Campbell (a E.S.). E.S. es el fundador de Damona Pharmaceuticals, una biofarmacéutica dedicada a llevar nuevos compuestos GABAérgicos a la clínica.
Materials
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
| Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
| Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
| Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
| Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
| GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
| GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
| Glycine | Sigma | W328707 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors – Serrated |
| Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors – Sharp |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
| Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |
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