تحسين تقنية معالجة زيت الضأن Epimedii Folium واختبار تأثيرها على التطور الجنيني لسمك الزرد
Summary
في هذا البروتوكول ، تم تحسين تقنية معالجة زيت الضأن ل Epimedii folium (EF) من خلال تطبيق منهجية سطح التصميم والاستجابة التجريبية Box-Behnken ، وتم التحقيق بشكل أولي في تأثير EF الخام والمحسنة المستخرجة بالماء على التطور الجنيني لسمك الزرد.
Abstract
كطب صيني تقليدي (TCM) ، فإن Epimedii folium (EF) له تاريخ في الطب والغذاء > عمره 2000 عام. سريريا ، غالبا ما يستخدم EF المعالج بزيت لحم الضأن كدواء. في السنوات الأخيرة ، زادت تدريجيا تقارير مخاطر السلامة وردود الفعل السلبية للمنتجات التي تستخدم EF كمادة خام. يمكن أن تؤدي المعالجة إلى تحسين سلامة الطب الصيني التقليدي بشكل فعال. وفقا لنظرية الطب الصيني التقليدي ، يمكن أن تقلل معالجة زيت الضأن من سمية EF وتعزز تأثيرها التنغيم على الكلى. ومع ذلك ، هناك نقص في البحث والتقييم المنهجي لتكنولوجيا معالجة زيت الضأن EF. في هذه الدراسة ، استخدمنا منهجية سطح التصميم والاستجابة التجريبية Box-Behnken لتحسين المعلمات الرئيسية لتكنولوجيا المعالجة من خلال تقييم محتويات المكونات المتعددة. أظهرت النتائج أن تقنية معالجة زيت الضأن المثلى ل EF كانت على النحو التالي: تسخين زيت لحم الضأن عند 120 درجة مئوية ± 10 درجة مئوية ، وإضافة EF الخام ، وقليه برفق إلى 189 درجة مئوية ± 10 درجة مئوية حتى يصبح لامعا بالتساوي ، ثم إزالته وتبريده. لكل 100 كجم من EF ، يجب استخدام 15 كجم من زيت لحم الضأن. تمت مقارنة السمية والمسخة لمستخلص مائي من EF الخام وزيت الضأن المعالج في نموذج نمو جنين الزرد. أظهرت النتائج أن مجموعة الأعشاب الخام كانت أكثر عرضة للتسبب في تشوهات الزرد ، وكان تركيز EF المميت نصف الأقصى أقل. في الختام ، كانت تقنية معالجة زيت الضأن المحسنة مستقرة وموثوقة ، مع إمكانية تكرار جيدة. عند جرعة معينة ، كان المستخلص المائي من EF ساما لتطور أجنة الزرد ، وكانت السمية أقوى بالنسبة للدواء الخام من الدواء المعالج. أظهرت النتائج أن معالجة زيت الضأن قللت من سمية الخام EF. يمكن استخدام هذه النتائج لتحسين الجودة والتوحيد والسلامة السريرية ل EF المعالج بزيت الضأن.
Introduction
Epimedii folium (EF) هي الأوراق المجففة ل Epimedium brevicornu Maxim. ، Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) مكسيم ، إبيمديوم بوبيسنسنس مكسيم ، أو إبيميديوم كوريانوم ناكاي. يمكن استخدام EF لعلاج هشاشة العظام ومتلازمة انقطاع الطمث وكتل الثدي وارتفاع ضغط الدم وأمراض القلب التاجية وأمراض أخرى1. كطب صيني تقليدي (TCM) ، تتمتع EF بتاريخ في الطب والغذاء لأكثر من 2000 عام. نظرا لانخفاض سعره وتأثيره الملحوظ في تنغيم الكلى ، فإنه يستخدم على نطاق واسع في الأدوية والأطعمة الصحية. تتم معالجة EF عن طريق قليها بزيت لحم الضأن ، وهي عملية تم وصفها لأول مرة في نظرية معالجة Lei Gong التي كتبها Lei Xiao في فترة Liu Song2. تختلف كفاءة EF الخام و EF المقلي تماما. يبدد EF الخام الروماتيزم بشكل أساسي ، في حين أن EF المقلي يسخن الكلى لتعزيز يانغ3. في الوقت الحاضر ، يستخدم EF على نطاق واسع كمادة خام في الأدوية والأطعمة الصحية. هناك 399 دواء صيني مدرج ، وتسعة أغذية صحية مستوردة ، و 455 من الأطعمة الصحية المحلية مع EF كمادة خام4. هذه المواد الطبية لديها آفاق تطبيق كبيرة. ومع ذلك ، في السنوات الأخيرة ، كانت هناك تقارير متزايدة عن ردود الفعل السلبية وإصابة الكبد البشري الناجمة عن الأطعمة الصحية وأدوية براءات الاختراع الصينية التي تستخدم EF كمادة خام ، وقد ذكرت دراسات السمية ذات الصلة5،6،7 أن EF كمادة خام لها مخاطر محتملة على السلامة.
تشير المعالجة الطبية الصينية إلى التقنيات الصيدلانية التي يمكن أن تقلل بشكل فعال أو تقضي على السمية وتحسن سلامة الطب الصيني التقليدي. طريقة المعالجة التقليدية ل EF هي القلي السريع بزيت لحم الضأن ، مما يقلل من سمية EF ويعزز تأثيره في تدفئة الكلى وتعزيز يانغ8. يتم تضمين طريقة المعالجة هذه في دستور الأدوية الصيني ومواصفات المعالجة المختلفة1. يتم تحديد عملية EF فقط على النحو التالي: لكل 100 كجم من EF ، تتم إضافة 20 كجم من الزيت الأمنيوسي (المكرر) ، ويتم إطلاقه بشكل خفيف حتى يصبح موحدا ولامعا1. لا توجد معلمات صارمة لطريقة معالجة EF في المعايير المذكورة أعلاه ، لذلك لم يتم توحيد مواصفات المعالجة المحلية لتوفير الاتساق. لذلك ، سيكون من المفيد إجراء دراسة منهجية لعملية EF. في هذا البحث ، تم استخدام طريقة سطح التصميم والاستجابة التجريبية Box-Behnken لتحسين تقنية معالجة EF.
التصميم التجريبي Box-Behnken هو طريقة تستخدم عادة لتحسين العوامل في العملية. يمكن تحسين معلمات الاستخراج من خلال إنشاء العلاقة الوظيفية بين عوامل ملاءمة معادلة الانحدار المتعددة وقيم التأثير. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع لدراسة استخراج الطب الصيني التقليدي5،6،7 ومعالجة9،10،11. أبلغت دراسات مختلفة عن طرق تحضير الطب الصيني التقليدي التي تتضمن معالجة الملح ومعالجة النبيذ والقلي السريع وفقا لتصميم Box-Behnken ، مثل Psoraleae fructus 12 المعالج بالملح ، و Cnidii fructus13 المعالج بالنبيذ ، و Cinnamomi ramulus14 المحمص. لقد قللت هذه الطريقة من وقت الاختبار ، ودقة الاختبار العالية ، وهي مناسبة للاختبارات متعددة العوامل ومتعددة المستويات. الطريقة أبسط من طريقة اختبار التصميم المتعامد وأكثر شمولا من طريقة التصميم الموحدة15. يمكن للعلاقات التي تم الحصول عليها تحديد القيمة المتوقعة لأي نقطة اختبار ضمن نطاق الاختبار ، وهي ميزة كبيرة. يمكن استخدام نموذج الزرد لاختبار ما إذا كانت EF أقل سمية بعد المعالجة.
في دراسات سمية الطب الصيني التقليدي ، يتمتع نموذج الزرد بمزايا مزدوجة تتمثل في الإنتاجية العالية لتجارب الخلايا وأوجه التشابه مع تجارب القوارض16. يتميز هذا النموذج بصغر حجمه وارتفاع معدل التفريخ ودورة التكاثر القصيرة وسهولة التكاثر. يمكن استخدام النموذج في التجارب المتزامنة واسعة النطاق في لوحات زراعة الخلايا ، وجرعة الدواء التجريبية صغيرة ، والدورة التجريبية قصيرة ، والتكلفة منخفضة ، والعملية التجريبية بأكملها سهلة الملاحظة والتشغيل17. أجنة الزرد شفافة وتتطور بسرعة. لذلك ، يمكن ملاحظة السمية والآثار المسخية للأدوية على الأنسجة الحشوية في مراحل النمو المختلفة مباشرة تحت المجهر18. يصل التماثل الجيني بين الزرد والبشر إلى 85٪ 18. يشبه مسار نقل إشارة الزرد مسار البشر18. التركيب البيولوجي والوظيفة الفسيولوجية لسمك الزرد متشابهان إلى حد كبير مع تلك الموجودة في الثدييات18. لذلك ، يمكن أن يوفر نموذج الزرد لاختبار المخدرات تجريبية موثوقة وقابلة للتطبيق بشكل كامل على البشر19.
في هذه الدراسة ، استخدمنا منهجية سطح استجابة التصميم Box-Behnken لتحسين كمية ودرجة حرارة زيت الضأن ودرجة حرارة القلي المستخدمة في تقنية معالجة EF ، مع محتويات icariin و epimedin A و epimedin B و epimedin C و baohuoside I كمؤشرات تقييم. تم استخدام نموذج الزرد لاستكشاف أولي لتأثير مستخلص الماء EF على التطور الجنيني لسمك الزرد قبل وبعد المعالجة لتقييم تأثير التوهين للمعالجة على EF.
Protocol
Representative Results
Discussion
المتغيرات المستقلة وتحديد مستوياتها
تم وصف تقنية معالجة EF فقط في إصدار 2020 من دستور الأدوية الصيني ومواصفات معالجة الأدوية الصينية المحلية المنشورة من قبل 26 مقاطعة وبلدية ومنطقة ذاتية الحكم في جميع أنحاء البلاد1. يتضمن الوصف الخطوات التالية: أخذ زيت لحم الضأن وتسخي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذا العمل من قبل مشروع أعمال البحث العلمي الأساسي لأكاديمية تشونغتشينغ للطب الصيني التقليدي (رقم المشروع: jbky20200013) ، ومشروع توجيه حوافز الأداء لمؤسسات البحث العلمي في تشونغتشينغ (رقم المشروع: cstc2021jxjl 130025) ، ومشروع بناء الانضباط الرئيسي للجنة الصحة البلدية في تشونغتشينغ لمعالجة المواد الطبية الصينية.
Materials
| Acetonitrile | Fisher | 197164 | |
Baohuoside  (B ) |
Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20042402 | |
| Chromatographic column | Waters Corporation | Symmetry C18 | |
| Design Expert software | Stat- Ease Inc., Minneapolis, MN | Trial Version8.0.6.1 | |
| Detector | Waters Corporation | 2998 | |
| Disintegrator | Hefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd. | S-FS553 | |
| Electronic analytical balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS205DU | |
| Epimedin A (EA) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-21112118 | |
| Epimedin B (EB) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080403 | |
| Epimedin C (EC) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080310 | |
| Ethanol | Chongqing Chuandong Chemical ( Group ) Co., Ltd. | 20180801 | |
| Graphpad software | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | 6.02 | |
| High Performance Liquid Chromatography (HPLC) | Waters Corporation | 2695 | |
| Icariin | Chengdu Glip Biotechnology Co., Ltd. | 21091401 | |
| Methanol | Chongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd. | 20171101 | |
| Microporous membrane | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd. | 0.22μm | |
| Mutton oil | Kuoshan Zhiniu Fresh Food Store | 20211106 | |
| Office Excel office software | Microsoft | Office Excel 2021 | |
| Pharmacopoeia sieve | Shaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd. | R40/3 | |
| Pure water machine | Chongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd. | AT Sro 10A | |
| Qualitative filter paper | Shanghai Leigu Instrument Co., Ltd. | 18cm | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi 2000 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd. | BUG25-12 | |
| Zebrafish | China Zebrafish Resource Center (CZRC) | The AB strain |
References
- Chinese Pharmacopoeia Commission. . Chinese Pharmacopoeia. Volume I. , (2020).
- Wang, X. T. . Collection of Traditional Chinese Medicine Processing Methods. , (1998).
- Chen, L. L., Jia, X. B., Jia, D. S. Advances in studies on processing mechanism of Epimedii Folium. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 12 (12), 2108-2111 (2010).
- Zhao, W., et al. Optimized extraction of polysaccharides from corn silk by pulsed electric field and response surface quadratic design. Journal of The Science of Food and Agriculture. 91 (12), 2201-2209 (2011).
- Zhao, L. C., et al. The use of response surface methodology to optimize the ultrasound-assisted extraction of five anthraquinones from Rheum palmatum L. Molecules. 16 (7), 5928-5937 (2011).
- Mao, W. H., Han, L. J., Shi, B. Optimization of microwave assisted extraction of flavonoid from Radix Astragali using response surface methodology. Separation Science and Technology. 43 (12), 671-681 (2008).
- Liu, W., et al. Optimization of total flavonoid compound extraction from Gynura medica leaf using response surface methodology and chemical composition analysis. International Journal of Molecular Sciences. 11 (11), 4750-4763 (2010).
- Guo, G. L., et al. Research progress on processing mechanism of Epimedium fried with sheep fat oil based on warming kidney and promoting yang. Journal of Liaoning University of TCM. 22 (07), 1-5 (2020).
- Shen, X. J., Zhou, Q., Sun, L. -. L., Dai, Y. -. P., Yan, X. -. S. Optimization for cutting procedure of astragali radix with Box-Behnken design and response surface method. China Journal of Chinese Materia Medica. 39 (13), 2498-2503 (2014).
- Wang, L. H., et al. Optimization of processing technology of honey wheat bran based on Box-Behnken response surface methodology. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 52 (12), 3538-3543 (2021).
- Zhang, J. B., et al. Study on integrated process of producing area and processing production for Paeoniae Radix Alba based on Box-Behnken response surface methodology. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (18), 5657-5662 (2022).
- Li, N., Zhang, X. M., Yao, Y. Y., Chen, Y. L., Fan, Q. Optimization of processing technology for Psoraleae Fructus by D-optimal response surface methodology with UHPLC. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 39 (05), 42-44 (2022).
- Jia, Y. Q., et al. Optimization of processing technology with wine of Cnidii Fructus by AHP-entropy weight method combined with response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 10, 2338-2343 (2022).
- Chen, F. G., et al. Optimization of the baked drying technology of Cinnamomi Ramulus based on CRITIC combined with Box-Behnken response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 2022 (08), 1838-1842 (2022).
- Wang, W. D., et al. Optimization extraction of effective constituents from Epimedii Herba based on central composite design-response surface methodology and orthogonal experimental design. Lishizhen Medicine and Materia Medica. 21 (11), 2766-2768 (2010).
- Yang, L., et al. Zebrafish embryos as models for embryotoxic and teratological effects of chemicals. Reproductive Toxicology. 28 (2), 245-253 (2009).
- Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
- Jayasinghe, C. D., Jayawardena, U. A. Toxicity assessment of herbal medicine using zebrafish embryos: A systematic review. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2019, 7272808 (2019).
- Scholz, S. Zebrafish embryos as an alternative model for screening of drug induced organ toxicity. Archives of Toxicology. 87 (5), 767-769 (2013).
- Ling, J., et al. Analysis of Folium Epimedium toxicity in combination with Radix Morindae Officinalis based on zebrafish toxicity/metabolism synchronization. Acta Pharmaceutica Sinica. 53 (1), 74 (2018).
- Wang, Y., et al. Tri-n-butyl phosphate delays tissue repair by dysregulating neutrophil function in zebrafish. Toxicology and Applied Pharmacology. 449, 116114 (2022).
- Sheng, Z. L., Li, J. C., Li, Y. H. Optimization of forsythoside extraction from Forsythia suspensa by Box-Behnken design. African Journal of Biotechnology. 10 (55), 11728-11737 (2011).
- Pang, X., et al. Prenylated flavonoids and dihydrophenanthrenes from the leaves of Epimedium brevicornu and their cytotoxicity against HepG2 cells. Natural Product Research. 32 (19), 2253-2259 (2018).
- Zhong, R., et al. The toxicity and metabolism properties of Herba Epimedii flavonoids on laval and adult zebrafish. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2019, 3745051 (2019).
- Zhang, L., et al. Effect of 2" -O-rhamnosyl icariside II, baohuoside I and baohuoside II in Herba Epimedii on cytotoxicity indices in HL-7702 and HepG2 cells. Molecules. 24 (7), 1263 (2019).
- Chen, Y., Yang, R. J., Yu, M., Ding, S. L., Chen, R. Q. Application of response surface methodology in modern production process optimization. Science & Technology Vision. 2016 (19), 36-39 (2016).
- Zhang, Y., et al. Progress in using zebrafish as a toxicological model for traditional Chinese medicine. Journal of Ethnopharmacology. 282, 114638 (2022).
- Oliveira, R., Domingues, I., Grisolia, C. K., Soares, A. M. V. M. Effects of triclosan on zebrafish early-life stages and adults. Environmental Science and Pollution Research. 16 (6), 679-688 (2009).
- Ton, C., Lin, Y., Willett, C. Zebrafish as a model for developmental neurotoxicity testing. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (7), 553-567 (2006).
- He, Q., et al. Toxicity induced by emodin on zebrafish embryos. Drug and Chemical Toxicology. 35 (2), 149-154 (2012).
- Chen, Y., et al. Developmental toxicity of muscone on zebrafish embryos. Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology. (6), 267-273 (2014).
- He, Y. L., et al. Effects of shikonin on zebrafish’s embryo and angiogenesis. Chinese Traditional Patent Medicine. 38 (2), 241-245 (2016).
- Zhou, Y. . The transformation research on the chemical compositions in the processing of Epimedium. , (2016).
- Xiao, Y. P., Zeng, J., Jiao, L. -. N., Xu, X. -. Y. Review for treatment effect and signaling pathway regulation of kidney-tonifying traditional Chinese medicine on osteoporosis. China Journal of Chinese Materia Medica. 43 (1), 21-30 (2018).
- Wang, R. H. Study on modern pharmacological effects of traditional Chinese medicine for tonifying kidney yang. Journal of Hubei University of Chinese Medicine. 13 (04), 63-66 (2011).
- Luo, L., et al. Advances in the chemical constituents and pharmacological studies of Epimedium. Asia-Pacific Traditional Medicine. 15 (6), 190-194 (2019).
- Liu, S., et al. Effects of icariin on ERβ gene expression and serum estradiol level in ovariectomized rats. Hunan Journal of Traditional Chinese Medicine. 32 (1), 150-152 (2016).
- Liu, Y., et al. Effects of epimedin A on osteoclasts and osteoporotic male mice. Chinese Journal of Veterinary Science. 41 (07), 1359-1364 (2021).
- Liu, Y. L., et al. Effects of icariin and epimedium C on microstructure of bone tissue in glucocorticoid osteoporosis model mice based on Micro-CT technique. Drug Evaluation Research. 43 (09), 1733-1739 (2020).
- Zhan, Y. Evaluation of antiosteoporotic activity for micro amount icariin and epimedin B based on the osteoporosis model using zebrafish. Chinese Pharmaceutical Journal. (24), 30-35 (2014).
- Zhan, Y., Wei, Y. -. J., Sun, E., Xu, F. -. J., Jia, X. -. B. Two-dimensional zebrafish model combined with hyphenated chromatographic techniques for evaluation anti-osteoporosis activity of epimendin A and its metabolite baohuoside I. Acta Pharmaceutica Sinica. 49 (06), 932-937 (2014).
