Summary
Mevcut protokol, farelerde uyku yoksunluğunu indüklemek için kullanılan uygun maliyetli bir rocker platform tabanlı cihaz kurmak için bir yöntemi özetlemektedir. Bu cihazın, elektroensefalogram (EEG) ile kanıtlanmış uyku düzenlerinde bozulmalara neden olmanın yanı sıra uyku yoksunluğu ile ilişkili metabolik ve moleküler değişiklikleri indüklemede etkili olduğu kanıtlanmıştır.
Abstract
Sirkadiyen ritim bozulması, dış çevre veya davranış ile sağlığı önemli ölçüde bozan endojen moleküler saat arasındaki senkronizasyonun bozulmasını ifade eder. Uyku yoksunluğu, sirkadiyen ritim bozulmasının en yaygın nedenlerinden biridir. Sağlık üzerindeki etkilerini araştırmak için farelerde uyku yoksunluğuna neden olmak için çeşitli yöntemler (örneğin, su üzerindeki platformlar, nazik kullanım, kayar çubuk odaları, dönen tamburlar, yörünge çalkalayıcılar, vb.) bildirilmiştir. Bu çalışma, farelerde uyku yoksunluğu için alternatif bir yöntem sunmaktadır. Ayarlanabilir zaman aralıklarında grup halinde barındırılan farelerde uygun maliyetli ve uykuyu verimli bir şekilde bozan otomatik bir rocker platformu tabanlı cihaz tasarlanmıştır. Bu cihaz, minimum stres tepkisi ile uyku yoksunluğunun karakteristik değişikliklerine neden olur. Sonuç olarak, bu yöntem, uyku yoksunluğunun çoklu hastalıkların patogenezi üzerindeki etkilerini ve altta yatan mekanizmaları incelemekle ilgilenen araştırmacılar için yararlı olabilir. Ayrıca, özellikle birden fazla uyku yoksunluğu cihazının paralel olarak çalışması gerektiğinde uygun maliyetli bir çözüm sunar.
Introduction
Sirkadiyen ritim bozulması, dış çevre veya davranış ile endojen biyolojik saat arasındaki senkronizasyonun bozulmasını ifade eder. Sirkadiyen ritim bozukluğunun en yaygın nedenlerinden biri uyku yoksunluğudur1. Uyku yoksunluğu sadece insan sağlığını olumsuz etkilemekle kalmaz, aynı zamanda kanser2 ve kardiyovasküler hastalıklar3 dahil olmak üzere birçok hastalığın riskini önemli ölçüde artırır. Bununla birlikte, uyku yoksunluğunun zararlı etkilerinin altında yatan mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir ve bu konudaki anlayışımızı geliştirmek için uyku yoksunluğu modelleri oluşturmak esastır.
Farelerde uyku yoksunluğu için su platformlarının4, nazik kullanım5, kayar çubuk odalarının6, dönen tamburların7 ve kafes ajitasyon protokollerinin5,8,9 kullanımı gibi çeşitli yöntemler bildirilmiştir. Kayar çubuk odaları, çubukları kafesin alt kısmı boyunca otomatik olarak süpürür ve fareleri üzerlerinden geçmeye ve uyanık kalmaya zorlar. Kafes ajitasyon protokolleri, kafeslerin laboratuvar orbital çalkalayıcılarına yerleştirilmesini içerir ve bu da verimli uyku bozukluğuna neden olur. Bu yöntemler otomatik ve etkili olsa da, özellikle sirkadiyen gen profillemesi için gerekli olan çok sayıda uykudan mahrum fareyi içeren özel çalışma tasarımları için, birden fazla cihazın paralel olarak çalışması gerektiğinde pahalı olabilirler. Öte yandan, su platformları ve nazik kullanım protokolleri, uyku yoksunluğunu indüklemek için yaygın olarak kullanılan daha ucuz ve daha basit yöntemlerdir. Bununla birlikte, su platformu, önceden belirlenmiş yoksunluk-dinlenme döngülerinin10,11 otomatik kontrolüne izin vermez ve nazik kullanım, araştırmacıların uykuyu bozmak için sürekli uyanık olmasını gerektirir. Ek olarak, dönen tamburlar gibi diğer yöntemler, sosyal izolasyon veya stres12 ile karıştırılabilir.
Orbital çalkalayıcı tabanlı yöntemden esinlenerek, farelerde uyku yoksunluğu için rocker platform tabanlı bir cihaz oluşturmak için bir protokol sunmayı amaçlıyoruz. Bu yöntem ucuz, etkili, minimum stresli, kontrol edilebilir ve otomatiktir. Mevcut protokol, erişilebilirliğimize bağlı olarak, yörünge çalkalayıcılardan yaklaşık on kat daha ucuz bir maliyetle rocker platform tabanlı bir cihaz oluşturmamıza izin veriyor. Bu cihaz, grup halinde barındırılan farelerde uykuyu etkili bir şekilde bozdu ve minimum stres tepkisi ile uyku yoksunluğunun karakteristik değişikliklerine neden oldu. Uyku yoksunluğunun çoklu hastalıkların patogenezi üzerindeki etkilerini ve altta yatan mekanizmalarını araştırmakla ilgilenen araştırmacılar için, özellikle de çalışma paralel olarak çok gruplu uyku yoksunluğunu içerdiğinde, özellikle yararlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmadaki tüm hayvan deney protokolleri, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi Renji Hastanesi Laboratuvar Hayvanları Refahı Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Çalışmada 8 ila 10 haftalık erkek C57BL / 6J fareleri kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz. Cihazı kurmak için gerekli ana parçalar Şekil 1A'da listelenmiştir.
1. Uyku yoksunluğu cihazının hazırlanması
- T şeklinde bir yapı oluşturmak için 50 cm'lik oluklu çelik kanalın bir ucunu 40 cm'lik oluklu çelik kanalın ortasına vidalarla sabitleyin (Malzeme Tablosuna bakın); işlemi tekrarlayın ve bu tür iki T şeklinde yapı yapın (Şekil 1B-a).
- T şeklindeki iki yapının 30 cm aralıklarla paralel olarak yukarı doğru durmasını sağlayın ve iki T şeklindeki yapının tabanlarını vidalar kullanarak 30 cm vida uyumlu bir çelik silindirle (bkz. Malzeme Tablosu) birleştirin (Şekil 1B-b).
- İki T şeklindeki yapı arasına çelik bir dikdörtgen platform (20 × 25 cm) (Malzeme Tablosuna bakın) yerleştirin (Şekil 1B-c).
NOT: Belirtilen boyutta kullanıma hazır çelik dikdörtgen platformlar mevcut değilse, 2 mm kalınlığındaki yassı çelikler kaynaklanarak yapılabilir. - Platforma tutturulmuş 30 cm'lik vida uyumlu çelik silindirin her iki ucunu, üstten 10 cm aşağıda T şeklindeki yapıların her birine sabitlenmiş iki yatağa sabitleyin (Şekil 1B-d).
- Vidaları kullanarak üstten 25 cm aşağıda T şeklindeki yapılardan birine bir motor montajını (bkz. Malzeme Tablosu) sabitleyin (Şekil 1B-e).
NOT: Alternatif olarak, motor montajını mürettebat yerine T şeklindeki yapıya sabitlemek için inşaat yapıştırıcısı kullanılabilir. - Motor yuvasına vidalarla bir motor takın (bkz. Malzeme Tablosu) (Şekil 1B-f).
- Motorun altındaki T şeklindeki yapıya kendinden kilitli bantlarla bir soğutma fanı (bkz. Malzeme Tablosu) sabitleyin (Şekil 1B-g).
- Bir biyel kolunun yatak ucunu vidaları kullanarak motora bakan bir platform köşesine sabitleyin (Şekil 1B-h).
- Biyel kolunun diğer ucunu vidaları kullanarak motor miline sabitleyin (Şekil 1B-i).
- Bir elektrikli matkap kullanarak plastik bir kabın veya standart hayvan kafesinin dört köşesinin her birine 4 mm'lik iki adet 4 mm'lik delik açın (Malzeme Tablosuna bakın) ve kafesin sol tarafında iki adet 4 mm'lik delik ve 6 mm'lik bir alt delik açın (Şekil 1B-j).
- Kafesi köşe deliklerinden kendinden kilitli bantlarla dikdörtgen platform üzerine sabitleyin (Şekil 1B-k).
- Elektrikli matkapla 50 mL'lik bir santrifüj tüpünün kapağına 5 mm'lik bir delik açın ve su sızıntısını önlemek için deliği küresel vana ile donatılmış uzun bir nozulla kapatın.
NOT: Su şişelerini özelleştirmek zorsa, hidrojel su temini için alternatif bir seçenek olacaktır. - Özelleştirilmiş su şişesini, nozul 4 mm'lik delikten geçecek şekilde iki 6 mm'lik delikten kendinden kilitli bantlar kullanarak kafesin sol tarafına sabitleyin (Şekil 1B-l).
- Güç tuğlası adaptörünün çıkış elektrik kablolarını motorun iki terminaline bağlayın (Şekil 1B-l).
NOT: Kabloları motor terminallerine bağlamak için belirli bir polarite gereksinimi yoktur. - Güç tuğlası adaptörünün giriş elektrik kablolarını zaman kontaktörüne bağlayın (Şekil 1B-m).
2. Uyku yoksunluğunun indüksiyonu
- Zaman kontaktörünün sol ve sağ yarısındaki en sağdaki artı işareti düğmelerine basın (Malzeme Tablosuna bakın), her iki taraftaki mekanik sayaçlarda "M" görünene kadar sırasıyla (Şekil 1C-a).
- Zaman kontaktörünün sol ve sağ yarısındaki orta artı işareti düğmelerine, her iki taraftaki mekanik sayaçlarda "5M" görünene kadar basın (Şekil 1C-b).
- Sol mekanik sayaçta "15M" görünene kadar zaman kontaktörünün sol yarısındaki en soldaki artı işareti düğmesine basın (Şekil 1C-c).
NOT: Zaman kontaktörü daha sonra döngüsel modda 15 dakika açık ve 5 dakika kapalı olacaktır. - Fareleri su ve yiyecek ad libitum ile kafese koyun.
- Zaman kontaktörüne ve soğutma fanına güç sağlayın.
NOT: Platform şimdi 10 rpm'de sallanacak. - Her fareyi her gün Zeitgeber saati 0'da (ZT0) tartın.
NOT: Işık sabah 8'den (ZT0) akşam 8'e (ZT12) kadar açıktır.
3. Oral glukoz tolerans testi
- Kuyruk damarlarından kan örneklemesi yaparak açlık farelerinde açlık glikoz seviyelerini ölçün.
- 1 mL şırınga kullanarak intraperitoneal olarak her fareye (2 g / kg vücut ağırlığı) glikoz çözeltisi enjekte edin.
- Kuyruk damarından kan örnekleri toplayın ve kan şekerini glikoz enjeksiyonundan sırasıyla 15 dakika, 30 dakika, 60 dakika ve 120 dakika sonra test edin.
- Testten sonra fareleri yiyecek ve su ad libitum ile kafese geri koyun.
4. Beyin dokularının toplanması
- Yeterli anesteziden sonra fareleri 3-5 dakika boyunca izoflurana (% 2) maruz bırakarak dekapite edin.
- Kafatasını ortaya çıkarın ve cerrahi makas kullanarak kafatasında 1 cm dikey bir kesim yapın.
- Beyin dokusunu ortaya çıkarmak için sivrisinek kanama durdurucuları kullanarak kafatasını çıkarın (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Kavisli cımbız kullanarak tüm beyni yavaşça kraniyal boşluktan çıkarın.
NOT: Beyin dokusu yerel politikalara göre çıkarılmalıdır. - Beyin dokusunu soğuk fosfat tamponlu salin (1x PBS, 4 °C) kullanarak yıkayın.
- Sağlam beyin dokusunu sıvı nitrojen içinde dondurun ve uzun süreli depolama için dokuyu -80 ° C'ye aktarın.
NOT: -80 ° C'de saklandığında, flaş donmuş beyin dokusu en az 6 ay boyunca stabildir.
5. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile gen ekspresyonunun saptanması
- Beyin dokularını 4 °C'de veya buz üzerinde çözdürün.
- Dokuyu 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve TRIzol bazlı yöntemi kullanarak toplam RNA'yı çıkarın13.
- RNA ekstraksiyonundan sonra bir spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonunu ölçün (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Ticari bir kit14 kullanarak toplam RNA'nın (1 μg) tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) ters transkripsiyonunu gerçekleştirin.
- Gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ile gen ekspresyon seviyelerini ölçün15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Farelerde uyku yoksunluğu için kurulan cihaz Şekil 1D'de gösterilmektedir. Uyku yoksunluğunun başlamasından sonraki 7. günde, elektroensefalogram (EEG) ve elektromiyografi (EMG) izleme16, cihazın farelerde uyku süresini önemli ölçüde azalttığını ve uyanıklık süresini artırdığını göstermiştir (Şekil 2A-D). Bu arada, mevcut protokol, başarılı uyku yoksunluğunun belirteçleri olan beyindeki Homer1a'nın adenozin birikimini ve mRNA seviyelerini önemli ölçüde artırdı (Şekil 2E, F)17. Bir ELISA kiti18 kullanarak, serum kortikosteron seviyelerinin mevcut uyku yoksunluğu protokolü tarafından önemli ölçüde değişmediğini gözlemledik (Şekil 2G). 7 gün boyunca uyku yoksunluğunun ardından, vücut ve timus ağırlığı önemli ölçüde azaldı (Şekil 3A-D), önceki raporlarla tutarlıolarak 19. Ayrıca, uyku yoksunluğundan sonra farelerde glukoz toleransı önemli ölçüde bozulmuştur (Şekil 3E, F). Saat gen ekspresyonundaki değişiklikleri araştırmak için, beyin dokuları bir gün boyunca her 4 saatte bir toplandı. Beyindeki saat genlerinin ekspresyon paternlerinin uyku yoksunluğundan sonra önemli ölçüde değiştiğini gözlemledik (Şekil 3G ve Tablo 1), bu da moleküler saatin bozulmasını düşündürüyor20.
Şekil 1: Rocker platform tabanlı cihazın kurulması. (A) Külbütör platformu tabanlı cihazın montajı için gerekli ana parçaları gösteren çizimler. (B) Uyku yoksunluğu cihazının montajını gösteren ayrıntılı adımlar. (C) Zaman kontaktöründe parametre ayarlarını gösteren görüntüler. (D) Tamamen monte edilmiş çalkalama odasının fotoğrafı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Farelerde uyku bozukluğu ve serum kortikosteron düzeylerinin değerlendirilmesi. (A) Uyku yoksunluğu sırasında farelerde EEG / EMG kaydını gösteren şematik diyagram. (B) Farelerde izlenen temsili EEG / EMG kayıtları. (C) Uyanıklık, NREM ve REM sırasında farelerde temsili EEG / EMG dalga formları. (D) Uykusu bozulmuş farelerde ve kontrol farelerinde (n = 4 fare / grup) kaydedilen uyanıklık süresi, NREM süresi ve REM süresi yüzdesi. *P < 0.05, ***P < 0.001. İstatistiksel analiz, eşleştirilmemiş bir t-testi kullanılarak yapıldı. Kısaltmalar: TO, kontrol grubu; NREM, Hızlı olmayan göz hareketi; REM, Hızlı göz hareketi; SD, uyku yoksunluğu grubu. (E) Uykusu bozulmuş farelerde ve kontrol farelerinde (n = 4 fare / grup) ölçülen beyin dokularındaki Homer1a'nın mRNA seviyeleri. *P < 0.05, İstatistiksel analiz, eşleştirilmemiş bir t-testi kullanılarak yapıldı. Kısaltmalar: TO, kontrol grubu; Homer1a, Homer iskele proteini 1a; SD, uyku yoksunluğu grubu. (F) Uyku bozukluğu olan farelerde ve kontrol farelerinde (n = 4 fare / grup) bir ELISA kiti kullanılarak ölçülen beyin dokusundaki adenosin içeriği. *P < 0.05, İstatistiksel analiz, her bir zaman noktasında eşleştirilmemiş t-testi kullanılarak yapıldı. Kısaltmalar: TO, kontrol grubu; SD, uyku yoksunluğu grubu. (G) Uykusu bozulmuş farelerde ve kontrol farelerinde ölçülen serum kortikosteron konsantrasyonu (zaman noktası / grup başına n = 4 fare). İstatistiksel analiz, iki yönlü varyans analizi kullanılarak yapıldı. Kısaltmalar: TO, kontrol grubu; SD, uyku yoksunluğu grubu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Farelerde uyku yoksunluğundan sonra patofizyolojik değişiklikler. (A) Belirtilen gruplardaki farelerin boyutlarını gösteren temsili resimler. Kısaltmalar: TO, kontrol grubu; SD, uyku yoksunluğu grubu. (B) Belirtilen gruplarda uyku yoksunluğunun başlamasından sonra vücut ağırlığındaki değişiklikler (grup başına n = 24 fare). **P < 0.001, istatistiksel analiz eşleştirilmemiş bir t-testi kullanılarak yapıldı. Kısaltmalar: TO, kontrol grubu; SD, uyku yoksunluğu grubu. (C) Belirtilen gruplardaki timüsün boyutlarını gösteren temsili resimler. Kısaltmalar: TO, kontrol grubu; SD, uyku yoksunluğu grubu. (D) İki grup arasında timus ağırlığının vücut ağırlığına oranlarının karşılaştırılması (grup başına n = 24 fare). **P < 0.001, istatistiksel analiz eşleştirilmemiş bir t-testi kullanılarak yapıldı. Kısaltmalar: TO, kontrol grubu; SD, uyku yoksunluğu grubu. (E) Belirtilen gruplarda intraperitoneal glukoz tolerans testi sonuçları (grup başına n = 5). *P < 0,01; **P < 0.001, istatistiksel analiz eşleştirilmemiş bir t-testi kullanılarak yapıldı. Kısaltmalar: TO, kontrol grubu; SD, uyku yoksunluğu grubu. (F) Uyku yoksunluğu grubu ile kontrol grubu (grup başına n = 5) arasında intraperitoneal glukoz tolerans testinin eğrisi (EAA) altındaki alanın karşılaştırılması. **P < 0.001, istatistiksel analiz eşleştirilmemiş bir t-testi kullanılarak yapıldı. Kısaltmalar: TO, kontrol grubu; SD, uyku yoksunluğu grubu. (G) Beyin dokularındaki saat genlerinin (Bmal1, Dbp, Cry1, Cry2, Nr1d1, Nr1d2, Per1 ve Per2) sirkadiyen ekspresyon paternleri uyku yoksunluğu grubunda ve kontrol grubunda ölçüldü (n = 4 fare). Veriler doğrusal olmayan kosinor regresyon kullanılarak karşılaştırıldı ve saat genlerinin ekspresyon eğrileri R paketi CircaCompare kullanılarak uyduruldu. P değerleri belirtildiği gibi sağlanır. Kısaltmalar: A, genlik; Bmal1, beyin ve kas Arnt benzeri 1; Cry1, kriptokrom sirkadiyen regülatör 1; Cry2, kriptokrom sirkadiyen regülatör 2; TO, kontrol grubu; Dbp, D-bölgesi bağlayıcı protein; M, mezor; Nr1d1, nükleer reseptör alt ailesi 1 grup D üyesi 1; Nr1d2, nükleer reseptör alt ailesi 1 grup D üyesi 2; P, faz; Per1, periyot sirkadiyen regülatörü 1; Per2, periyot sirkadiyen regülatörü 2; SD, uyku yoksunluğu grubu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Saat genleri | Bmal (Türkçe) | Dbp | Ağlamak1 | Ağlama2 | Nr1d1 | Nr1d2 | Per1 | Per2 | |
| Ritmiklik | Kontrol | P < 0.05 | P < 0.01 | P < 0.001 | P < 0.05 | P < 0.001 | P < 0.01 | P < 0.001 | P < 0.001 |
| Uyku yoksunluğu | P < 0.05 | P < 0.001 | P < 0.001 | P < 0.001 | P < 0.001 | P < 0.001 | P < 0.001 | P < 0.001 | |
| Akrofaz (Zeitgeber saati) | Kontrol | 22 | 12 | 17 | 15 | 11 | 14 | 14 | 16 |
| Uyku yoksunluğu | 10 | 24 | 4 | 3 | 22 | 0 | 1 | 1 | |
| Mesor tahmini | Kontrol | 0.933 | 2.242 | 1.136 | 1.171 | 1.799 | 1.41 | 1.289 | 1.033 |
| Uyku yoksunluğu | 0.826 | 2.101 | 1.094 | 1.155 | 1.756 | 1.399 | 0.999 | 0.888 | |
| Genlik tahmini | Kontrol | 0.099 | 0.746 | 0.305 | 0.131 | 0.494 | 0.314 | 0.294 | 0.341 |
| Uyku yoksunluğu | 0.108 | 0.866 | 0.342 | 0.168 | 0.503 | 0.323 | 0.388 | 0.305 | |
Tablo 1: Her grupta test edilen saat genleri için ritmiklik, mesor tahmini, genlik tahmini ve akrofazın varlığı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uyku yoksunluğunun fare modelleri, uyku bozukluğunun kardiyovasküler hastalık21, psikiyatrik durumlar22 ve nörolojik bozukluklar23 dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar üzerindeki etkilerini incelemek için gereklidir. Farelerde mevcut uyku yoksunluğu stratejileri arasında, tekrarlayan kısa süreli uyku kesintisini içeren fiziksel yaklaşımlar en sık kullanılanlardır 5,7,12. Bu fiziksel yaklaşımlar, su platformlarının4, nazik elleçleme5, kayar çubuk odalarının6,24, dönen tamburların7 veya yörüngesel çalkalayıcıların8,9,25,26 kullanımını içerir.
Farelerde uyku yoksunluğunu etkili bir şekilde indüklemek için ideal yöntemler, fareleri stresli olmayan bir uyaranla uyandırmalıdır. Seçilen cihaz ayrıca yoksunluk-dinlenme döngülerini ayarlamak için otomatikleştirilmeli ve kolayca kontrol edilebilmelidir. Bahsedilen yöntemler arasında, kayar çubuk haznesi bu gereksinimlerin çoğunu karşılar. Bununla birlikte, pahalıdır ve bazen farelere zarar verebilir. Bir başka etkili ve minimum stresli yöntem, bir zaman kontrolörüne bağlı standart bir laboratuvar yörünge çalkalayıcısına bir kafesin yerleştirildiği ve tekrarlayan uyku kesintisine yol açan yörünge çalkalayıcı tabanlı protokol 7,8,9,25'tir. Bununla birlikte, belirli çalışma tasarımları paralel olarak çalışmak için birden fazla yörünge çalkalayıcısı gerektirdiğinde, maliyet bazı araştırma grupları için engelleyici olabilir.
Orbital çalkalayıcı yöntemlerinden esinlenen mevcut çalışma, rocker platform tabanlı bir uyku yoksunluğu ekipmanı oluşturmak için ayrıntılı bir adım adım protokol sunmaktadır. Maliyeti, laboratuvar orbital çalkalayıcılarının yaklaşık onda biri kadardır ve bu da onu daha erişilebilir kılar. Tanıtılan cihazın, önemli ölçüde kısaltılmış uyku süresi ve artmış uyku yoksunluğu belirteçleri gösteren EEG / EMG izleme verileriyle belirtildiği gibi, farelerde uyku yoksunluğunda etkili olduğu doğrulandı. Ek olarak, bu rocker platform tabanlı cihaz, farelerde serum kortikosteron düzeylerini önemli ölçüde değiştirmedi. Genel olarak, ucuz, etkili, minimum stresli ve kontrol edilebilir yeni bir otomatik uyku yoksunluğu cihazı tanıttık.
Avantajlarına rağmen, mevcut protokolün bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, kullanıma hazır ticari olarak temin edilebilen cihazlardan farklı olarak, burada tanıtılan uyku yoksunluğu cihazı, deneyciler tarafından monte edilmesini gerektirir. Bununla birlikte, süreci basitleştirmek için ayrıntılı adım adım protokoller ve çizimler sağlanmıştır. İkinci olarak, cihazın kurulması için gerekli tüm malzemeler ticari olarak mevcut değildir ve bu çalışmada sağlanan özelliklere bağlı olarak bazı malzemelerin özelleştirilmesi gerekebilir. Üçüncüsü, külbütör platformuyla birlikte kullanılan geleneksel su şişelerinde sızıntı olabilir ve bu sorunu önlemek için özelleştirilmiş su şişelerinin kullanılmasını gerektirebilir.
Sonuç olarak, bu çalışma, grup halinde barındırılan farelerde uyku yoksunluğunu indüklemek için alternatif bir cihaz oluşturmak için uygun maliyetli ve verimli bir yöntem sunmaktadır. Bu protokol, araştırmacılara uyku yoksunluğunun çok çeşitli sağlık koşulları üzerindeki etkilerini ve altta yatan mekanizmaları araştırmalarında yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82230014, 81930007, 82270342), Şanghay Üstün Akademik Liderler Programı (18XD1402400), Şanghay Belediyesi Bilim ve Teknoloji Komisyonu (22QA1405400, 201409005200, 20YF1426100), Şanghay Pujiang Yetenek Programı (2020PJD030), SHWSRS(2023-62), Şanghay Yaşlanma ve Tıp Klinik Araştırma Merkezi (19MC1910500) ve Bengbu Tıp Fakültesi Lisansüstü İnovasyon Programı (Byycxz21075).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 50 mL centrifuge tube | NEST | 602002 | |
| Adenosine ELISA kit | Ruifan technology | RF8885 | |
| Animal cage | ZeYa tech | MJ2 | |
| Blood glucose meter | YuYue | 580 | |
| C57BL/6J Mice | JieSiJie Laboratory Animal | N/A | Age: 8-10 weeks |
| Connecting rod | ShengXiang Tech | N/A | Length: 20 cm |
| Cooling fan | LiMing | EFB0805VH | Supply voltage: 5 V; Power consumption: 1.2 W; Air flow: 26.92 cfm; Dimensions: 40 mm * 40 mm * 56 mm |
| Corticosterone ELISA kit | Elabscience | E-OSEL-M0001 | |
| EEG/EMG recording and analysis system | Pinnacle Technology | 8200-K1-iSE3 | |
| Isoflurane | RWD | 20071302 | |
| mosquito hemostats | FST | 13011-12 | Surgical instrument |
| Motor and motor mount | MingYang | MY36GP-555 | Supply voltage: 24 V dc; Shaft diameter: 8 mm; Maximum output torque: 100 Kgf.cm; Maximum output speed: 10 rpm |
| NanoDrop 2000c | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Power brick adapter | MingYang | QiYe-0243 | Input voltage: 110-220V ac; Output voltage: 24 V dc; Outputcurrent: 2 A; Cable length: 2 m |
| qPCR commercial kit | Vazyme | Q711-02 | |
| qPCR measurement equipment | Roche | 480 | |
| Rectangle platform attached with a screw-compatible steel cylinder | Customized | N/A | Width: 20 cm; length: 25 cm; length of the cylinder: 30 cm, thickness: 2 mm |
| Reverse RNA to cDNA commercial kit | Vazyme | R323-01 | |
| Screw and nut | Guwanji | N/A | Inner diameter: 6 mm, 12 mm |
| Screw-compatible steel cylinder | Customized | N/A | Length: 300 mm |
| Slotted steel channels | Customized | N/A | Length: 400 mm or 500 mm, thickness: 2 mm |
| Time contactor | LiXiang | DH48S-S | Supply voltage: 110-220 V ac; Units measured: hours, minutes, seconds; Contact configuration: DPDT |
| TRIzol | Vazyme | R401-01 |
References
- Yang, D. F., et al. Acute sleep deprivation exacerbates systemic inflammation and psychiatry disorders through gut microbiota dysbiosis and disruption of circadian rhythms. Microbiological Research. 268, 127292 (2023).
- Alanazi, M. T., Alanazi, N. T., Alfadeel, M. A., Bugis, B. A. Sleep deprivation and quality of life among uterine cancer survivors: systematic review. Supportive Care In Cancer : Official Journal of the Multinational Association of Supportive Care In Cancer. 30 (3), 2891-2900 (2022).
- Tobaldini, E., et al. Sleep, sleep deprivation, autonomic nervous system and cardiovascular diseases. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 74, 321-329 (2017).
- Arthaud, S., et al. Paradoxical (REM) sleep deprivation in mice using the small-platforms-over-water method: polysomnographic analyses and melanin-concentrating hormone and hypocretin/orexin neuronal activation before, during and after deprivation. Journal of Sleep Research. 24 (3), 309-319 (2015).
- Saré, R. M., et al. Chronic sleep restriction in developing male mice results in long lasting behavior impairments. Frontiers In Behavioral Neuroscience. 13, 90 (2019).
- Roman, V., Vander Borght, K., Leemburg, S. A., Vander Zee, E. A., Meerlo, P. Sleep restriction by forced activity reduces hippocampal cell proliferation. Brain Research. 1065 (1-2), 53-59 (2005).
- Zhao, H. Y., et al. Chronic sleep restriction induces cognitive deficits and cortical beta-amyloid deposition in mice via BACE1-antisense activation. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (3), 233-240 (2017).
- Lord, J. S., et al. Early life sleep disruption potentiates lasting sex-specific changes in behavior in genetically vulnerable Shank3 heterozygous autism model mice. Molecular Autism. 13 (1), 35 (2022).
- Sinton, C. M., Kovakkattu, D., Friese, R. S. Validation of a novel method to interrupt sleep in the mouse. Journal of Neuroscience Methods. 184 (1), 71-78 (2009).
- Rotenberg, V. S. Sleep after immobilization stress and sleep deprivation: common features and theoretical integration. Critical Reviews in Neurobiology. 14 (3-4), 225-231 (2000).
- Kim, T. K., et al. Melatonin modulates adiponectin expression on murine colitis with sleep deprivation. World Journal of Gastroenterology. 22 (33), 7559 (2016).
- Barf, R. P., Scheurink, A. J. Sleep disturbances and glucose homeostasis. European Endocrinology. 7, 14-18 (2011).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Libus, J., Štorchová, H. Quantification of cDNA generated by reverse transcription of total RNA provides a simple alternative tool for quantitative RT-PCR normalization. Biotechniques. 41 (2), 156-164 (2006).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nature Protocols. 1 (3), 1559-1582 (2006).
- Mang, G. M., et al. Evaluation of a piezoelectric system as an alternative to electroencephalogram/electromyogram recordings in mouse sleep studies. Sleep. 37 (8), 1383-1392 (2014).
- Maret, S., et al. Homer1a is a core brain molecular correlate of sleep loss. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (50), 20090-20095 (2007).
- Li, K., et al. Olfactory deprivation hastens Alzheimer-like pathologies in a human tau-overexpressed mouse model via activation of cdk5. Molecular neurobiology. 53, 391-401 (2016).
- Sousa, M. E., et al. Invariant Natural Killer T cells resilience to paradoxical sleep deprivation-associated stress. Brain, Behavior, and Immunity. 90, 208-215 (2020).
- Zhao, Y., et al. Disruption of circadian rhythms by shift work exacerbates reperfusion injury in myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 79 (21), 2097-2115 (2022).
- Miller, M. A., Cappuccio, F. P. Inflammation, sleep, obesity and cardiovascular disease. Current Vascular Pharmacology. 5 (2), 93-102 (2007).
- Minkel, J., et al. Sleep deprivation potentiates HPA axis stress reactivity in healthy adults. Health Psychology. 33 (11), 1430 (2014).
- Bishir, M., et al. Sleep deprivation and neurological disorders. BioMed Research International. 2020, 5764017 (2020).
- Franken, P., Tobler, I., Borbély, A. A. Cortical temperature and EEG slow-wave activity in the rat: analysis of vigilance state related changes. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 420 (5-6), 500-507 (1992).
- Li, Y., et al. Effects of chronic sleep fragmentation on wake-active neurons and the hypercapnic arousal response. Sleep. 37 (1), 51-64 (2014).
- Jones, C. E., et al. Early-life sleep disruption increases parvalbumin in primary somatosensory cortex and impairs social bonding in prairie voles. Science Advances. 5 (1), (2019).
