Fluorometria funzionale sito-diretta in cellule native per studiare l'eccitabilità del muscolo scheletrico
Summary
La fluorometria funzionale sito-diretta è un metodo per studiare i movimenti del dominio proteico in tempo reale. La modifica di questa tecnica per la sua applicazione nelle cellule native consente ora il rilevamento e il tracciamento dei movimenti di singoli sensori di tensione dai canali Ca2+ voltaggio-dipendenti nelle fibre muscolari scheletriche isolate murine.
Abstract
La fluorometria funzionale sito-diretta è stata la tecnica scelta per studiare la relazione struttura-funzione di numerose proteine di membrana, compresi i canali ionici voltaggio-dipendenti. Questo approccio è stato utilizzato principalmente nei sistemi di espressione eterologa per misurare simultaneamente le correnti di membrana, la manifestazione elettrica dell’attività dei canali e le misurazioni di fluorescenza, riportando riarrangiamenti di dominio locale. La fluorometria funzionale diretta dal sito combina elettrofisiologia, biologia molecolare, chimica e fluorescenza in un’unica tecnica ad ampio raggio che consente lo studio dei riarrangiamenti strutturali in tempo reale e della funzione attraverso la fluorescenza e l’elettrofisiologia, rispettivamente. Tipicamente, questo approccio richiede un canale di membrana voltaggio-dipendente ingegnerizzato che contiene una cisteina che può essere testata da un colorante fluorescente tiolo-reattivo. Fino a poco tempo fa, la chimica tiolo-reattiva utilizzata per la marcatura fluorescente sito-diretta delle proteine veniva effettuata esclusivamente negli ovociti e nelle linee cellulari di Xenopus , limitando la portata dell’approccio alle cellule primarie non eccitabili. Questo rapporto descrive l’applicabilità della fluorometria funzionale sito-diretta nelle cellule muscolari scheletriche adulte per studiare le prime fasi dell’accoppiamento eccitazione-contrazione, il processo mediante il quale la depolarizzazione elettrica delle fibre muscolari è legata all’attivazione della contrazione muscolare. Il presente protocollo descrive le metodologie per progettare e trasfettare canali Ca2+ voltaggio-dipendenti ingegnerizzati con cisteina (CaV1.1) in fibre muscolari del flessore digitorum brevis di topi adulti utilizzando l’elettroporazione in vivo e le successive fasi richieste per le misure funzionali di fluorometria dirette al sito. Questo approccio può essere adattato per studiare altri canali ionici e proteine. L’uso della fluorometria funzionale sito-diretta del muscolo dei mammiferi è particolarmente rilevante per lo studio dei meccanismi di base dell’eccitabilità.
Introduction
La capacità di tracciare i riarrangiamenti conformazionali dei canali ionici in risposta a uno stimolo elettrico noto in una cellula vivente è una fonte di informazioni preziose per la fisiologia molecolare1. I canali ionici voltaggio-dipendenti sono proteine di membrana che rilevano i cambiamenti nella tensione transmembrana e la loro funzione è influenzata anche dalle variazioni di tensione2. Lo sviluppo delle tecniche di tension-clamp nel secolo scorso ha permesso ai fisiologi di studiare, in tempo reale, le correnti ioniche trasportate dai canali ionici voltaggio-dipendenti in risposta alla depolarizzazione della membrana3. L’uso della tecnologia dei morsetti di tensione è stato cruciale per comprendere le proprietà elettriche delle cellule eccitabili come neuroni e muscoli. Nel 1970, il raffinamento del morsetto di tensione ha permesso il rilevamento delle correnti di gating (o movimento di carica)nei canali di calcio (Ca V) e sodio (NaV) 4,5. Le correnti di gating sono correnti capacitive non lineari che derivano dal movimento dei sensori di tensione in risposta ai cambiamenti nel campo elettrico attraverso la membrana cellulare6. Le correnti di gating sono considerate una manifestazione elettrica di riarrangiamenti molecolari che precedono o accompagnano l’apertura del canale ionico7. Mentre queste misurazioni di corrente forniscono preziose informazioni sulla funzione del canale, sia le correnti ioniche che le correnti di gating sono letture indirette di riarrangiamenti conformazionali inter- e intra-molecolari dei canali voltaggio-dipendenti7.
La fluorometria funzionale diretta al sito (FSDF; nota anche come fluorometria a morsetto di tensione, VCF) è stata sviluppata nei primi anni 19908 e, per la prima volta, ha fornito la possibilità di visualizzare direttamente i cambiamenti conformazionali locali e la funzione di una proteina canale in tempo reale. Utilizzando una combinazione di mutagenesi dei canali, elettrofisiologia e sistemi di espressione eterologa, è possibile etichettare e tracciare in modo fluorescente le parti mobili di specifici canali o recettori in risposta allo stimolo attivante 9,10. Questo approccio è stato ampiamente utilizzato per studiare i meccanismi di rilevamento della tensione nei canali ionici voltaggio-dipendenti 8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Per le recensioni autorevoli, vedi 10,20,21,22,23.
I canali Ca V e NaV, critici per l’avvio e la propagazione dei segnali elettrici, sono composti da una subunità principale α1, che possiede un poro centrale e quattro domini di rilevamento della tensione non identici2. Oltre alla loro distinta struttura primaria, i canali Ca V e NaV sono espressi come complessi multisubunità con subunità ausiliarie24. I canali del potassio voltaggio-dipendenti (K V) sono costituiti da quattro subunità che assomigliano a un singolo dominio di Na V o CaV 25. La subunità α1 che forma i pori e il rilevamento della tensione dei canali Ca V e NaV è formata da un singolo polipeptide che codifica per quattro domini individuali di sei segmenti transmembrana unici (S1-S6; Figura 1A) 24,26. La regione compresa dai segmenti transmembrana da S1 a S4 forma il dominio di rilevamento della tensione (VSD) e i segmenti transmembrana S5 e S6 formano il dominio dei pori26. In ogni VSD, la α-elica S4 contiene arginina o lisina caricata positivamente (Figura 1A,B) che si muovono in risposta alla depolarizzazione della membrana7. Diversi decenni di ricerca e i risultati di approcci sperimentali molto diversi supportano la premessa che i segmenti S4 si spostano verso l’esterno, generando correnti di gating, in risposta alla depolarizzazione della membrana6.
La FSDF misura i cambiamenti di fluorescenza di un colorante tiolo-reattivo coniugato a uno specifico residuo di cisteina (cioè la α-elica S4) su un canale ionico o altra proteina, ingegnerizzata tramite mutagenesi sito-diretta, mentre il canale funziona in risposta alla depolarizzazione della membrana o ad altri stimoli10. In effetti, FSDF è stato originariamente sviluppato per indagare se il segmento S4 nei canali KV, proposto per essere il principale sensore di tensione del canale, si muove quando le cariche di gating si muovono in risposta ai cambiamenti nel potenziale di membrana 8,10. In caso di canali ionici voltaggio-dipendenti, FSDF può risolvere riarrangiamenti conformazionali indipendenti dei quattro VSD (tracciando un VSD in un dato momento), in concomitanza con le misurazioni della funzione del canale. Infatti, utilizzando questo approccio, è stato dimostrato che i singoli VSD sembrano essere coinvolti in modo differenziale in aspetti specifici dell’attivazione e inattivazione del canale 12,27,28,29,30. Identificare il contributo di ciascun VSD alla funzione dei canali è di grande rilevanza e può essere utilizzato per chiarire ulteriormente il funzionamento del canale e potenzialmente identificare nuovi obiettivi per lo sviluppo di farmaci.
L’uso della FSDF nei sistemi di espressione eterologa è stato estremamente utile per approfondire la nostra comprensione della funzione del canale da una prospettiva riduzionista10,23. Come molti approcci riduzionisti, presenta vantaggi ma ha anche dei limiti. Ad esempio, una delle principali limitazioni è la parziale ricostituzione del canale nano ambiente nel sistema eterologo. Spesso i canali ionici interagiscono con numerose subunità accessorie e numerose altre proteine che modificano la loro funzione31. In linea di principio, canali diversi e le loro subunità accessorie possono essere espressi in sistemi eterologhi con l’uso di costrutti codificanti proteine multiple o plasmidi policistronici, ma il loro ambiente nativo non può essere completamente ricostituito30,32.
Il nostro gruppo ha recentemente pubblicato una variante della FSDF nelle fibre muscolari scheletriche dissociate native per lo studio delle prime fasi dell’accoppiamento eccitazione-contrazione (ECC)33,34, il processo mediante il quale la depolarizzazione elettrica delle fibre muscolari è legata all’attivazione della contrazione muscolare35,36. Per la prima volta, questo approccio ha permesso il tracciamento del movimento di singoli sensori di tensione S4 dal canale Ca2+ di tipo L voltaggio-dipendente (CaV1.1, noto anche come DHPR) nell’ambiente nativo di una fibra muscolare differenziata adulta37. Ciò è stato ottenuto considerando molteplici caratteristiche di questo tipo di cellula, tra cui l’attività elettrica della cellula che consente una rapida depolarizzazione auto-propagata indotta dalla stimolazione, la capacità di esprimere il plasmide di cDNA attraverso l’elettroporazione in vivo, l’alta espressione naturale e l’organizzazione compartimentale dei canali all’interno della cellula e la sua compatibilità con l’imaging ad alta velocità e i dispositivi di registrazione elettrofisiologica. In precedenza, abbiamo utilizzato un microscopio confocale a scansione lineare ad alta velocità come dispositivo di rilevamento37. Ora, una variante della tecnica viene presentata utilizzando un fotodiodo per l’acquisizione del segnale. Questo sistema di rilevamento basato su fotodiodi potrebbe facilitare l’implementazione di questa tecnica in altri laboratori.
Qui viene descritto un protocollo passo-passo per utilizzare FSDF in celle native per lo studio del movimento individuale del sensore di tensione da CaV1.1. Mentre il canale CaV1.1 è stato usato come esempio in tutto questo manoscritto, questa tecnica potrebbe essere applicata a domini extracellulari accessibili di altri canali ionici, recettori o proteine di superficie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui viene descritto un protocollo passo-passo per condurre FSDF nelle fibre muscolari per lo studio dei singoli movimenti del sensore di tensione dal canale CaV1.1. Anche se il numero di passaggi e la diversità degli approcci che sono combinati in questa tecnica possono sembrare complessi, la maggior parte di queste tecniche sono spesso utilizzate di routine nei laboratori di biofisici / biologi cellulari. Pertanto, l’apparente complessità risiede principalmente nella combinazione di tutti i vari approcci in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. J. Vergara (Università della California, Los Angeles) per aver condiviso il plasmide wild-type EGFP-CaV1.1 (coniglio). Si ringrazia lo Yale Department of Physiology Electronics Laboratory e soprattutto Henrik Abildgaard per la progettazione e la realizzazione del fotodiodo con circuito track and hold. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Institutes of Health R01-AR075726 e R01-NS103777
Materials
| Hyaluronidase | SIGMA ALDRICH | H3884-50mg | |
| 0.5 mL Eppendorf tube | Millipore Sigma | EP022363719-500EA | |
| 1 mL syringe | Millipore Sigma | Z683531-100EA | tuberculine slip tip |
| 1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe | Becton Dikinson | 324702 | |
| 35 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 353001 | |
| 60 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 351007 | |
| Alcoholic whip | PDI | B60307 | |
| Alexa-533 cube LP | Chroma | 49907 | Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp |
| Arc lamp | Sutter Instrumets | LB-LS 672 | |
| Artificial tears cream | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4" | VWR | 14672-200 | |
| BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide) | SIGMA ALDRICH | 203895 | |
| collagenase type I | SIGMA ALDRICH | C0130-1g | |
| Cotton tip | VWR | VWR-76048-960-BG | |
| Double electrode array (for electroporation) | BTX harvard apparatus | 45-0120 | 10mm 2 needle array tips |
| EGFP cube | Chroma | 39002AT | Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m |
| Electroporation apparatus device | BTX harvard apparatus | ECM 830 | |
| EPC10 | HEKA Elektronik GmbH (Harvard Bioscience) | 895000 | |
| FBS | Biotechne, R&D Systems | RND-S11150H | Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated |
| glass coverslip 35 mm dish | MatTek Life Science | P35G-1.5-14-C | |
| Isoflurane | Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation | 502017-250ml | |
| Isothermal heating pad | Braintree scientific inc | 39DP | |
| Laminin | Thermo Fisher | INV-23017015 | Laminin Mouse Protein, Natural |
| Latex bulb | VWR | 82024-554 | |
| LED 530 nm | Sutter Instrumets | 5A-530 | |
| Low binding protein 0.2 μm sterile filter | Pall | FG4579 | acrodisk syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic |
| MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
| MTS-5-TAMRA | Biotium | 89410-784 | MTS-5-TAMRA |
| OriginPro Analysis Software | OriginLab Corporation | OriginPro 2022 (64-bit) SR1 | |
| Photodiode | Custom Made | NA | |
| PlanApo 60x oil 1.4 N.A/∞/0.17 | Olympus | BFPC2 | |
| Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis | SIGMA | 267228-1G | To manufacyte field stimulation electrode |
| Pulse Generator | WPI | Pulsemaster A300 | |
| Shutter drive controller | Uniblitz | 100-2B | |
| Shuttter | Uniblitz | VS2582T0-100 | |
| S-MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
| Sterile bench pad | VWR | DSI-B1623 | |
| Sterile saline | SIGMA ALDRICH | S8776 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer kit | Dow Corning | 1419447-1198 | |
| Vaporizer for Anesthesia | Parkland Scientific | V3000PK | |
| Voltage generator | Custom Made | NA |
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