Summary

זרימת עבודה משולבת לחקר ארכיטקטורת הגנום המרחבי-זמני הממוקדת במקדם באוכלוסיות תאים נדירות

Published: April 21, 2023
doi:

Summary

ביטוי גנים מוסדר על ידי אינטראקציות של מקדמי גנים עם אלמנטים רגולטוריים דיסטליים. כאן, אנו מסבירים עד כמה קלט נמוך Capture Hi-C (liCHi-C) מאפשר לזהות אינטראקציות אלה בסוגי תאים נדירים, שבעבר לא היו ניתנים למדידה.

Abstract

שעתוק גנים מרחבי-זמני מוסדר באופן הדוק על ידי אלמנטים רגולטוריים דיסטליים, כגון משפרים ומשתיקי קול, המסתמכים על קרבה פיזית עם מקדמי גני המטרה שלהם כדי לשלוט בשעתוק. למרות שקל לזהות אלמנטים רגולטוריים אלה, קשה לחזות את גני המטרה שלהם, שכן רובם ספציפיים לסוג התא וניתן להפריד אותם על ידי מאות קילו-בסיסים ברצף הגנום הליניארי, תוך דילוג על גנים אחרים שאינם מטרה. במשך מספר שנים, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) היה תקן הזהב לשיוך של אלמנטים רגולטוריים דיסטליים לגני המטרה שלהם. עם זאת, PCHi-C מסתמך על זמינותם של מיליוני תאים, ואוסר על מחקר של אוכלוסיות תאים נדירות כגון אלה המתקבלות בדרך כלל מרקמות ראשוניות. כדי להתגבר על מגבלה זו, פותחה Capture Hi-C (liCHi-C), שיטה חסכונית וניתנת להתאמה אישית לזיהוי רפרטואר של אלמנטים רגולטוריים דיסטליים השולטים בכל גן בגנום. liCHi-C מסתמך על מסגרת ניסויית וחישובית דומה לזו של PCHi-C, אך על ידי שימוש בשינויים מינימליים בצינור, שינוי ריכוז המגיב ונפחי הריאגנטים, והחלפה או ביטול שלבים, הוא אחראי לאובדן חומרים מינימלי במהלך בניית הספרייה. באופן קולקטיבי, liCHi-C מאפשר לחקור את בקרת הגנים ואת ארגון הגנום המרחבי-זמני בהקשר של ביולוגיה התפתחותית ותפקוד תאי.

Introduction

ביטוי גנים זמני מניע התמיינות תאים, ובסופו של דבר, התפתחות אורגניזם, והשינוי שלו קשור קשר הדוק למגוון רחב של מחלות 1,2,3,4,5. שעתוק גנים מוסדר היטב על ידי פעולתם של אלמנטים רגולטוריים, אשר יכולים להיות מסווגים כפרוקסימליים (כלומר, מקדמי גנים) ודיסטליים (למשל, משפרים או משתיקי קול), אשר האחרונים ממוקמים לעתים קרובות הרחק מגני המטרה שלהם ומתקשרים איתם פיזית באמצעות לולאת כרומטין כדי לווסת ביטוי גנים 6,7,8.

זיהוי אזורי הבקרה הדיסטליים בגנום הוא עניין המוסכם על כולם, שכן אזורים אלה מכילים שינויים ספציפיים בהיסטון 9,10,11 ומכילים מוטיבים ספציפיים של זיהוי גורמי שעתוק, המשמשים כפלטפורמות גיוס עבורם12,13,14. חוץ מזה, במקרה של משפרים ומשפרי על 15,16, יש להם גם תפוסה נמוכה של נוקלאוזומים 17,18 והם משועתקים ל-eRNA לא מקודד 19,20.

עם זאת, קשה יותר לחזות את גני המטרה של כל אלמנט ויסטלי דיסטלי. לעתים קרובות יותר, אינטראקציות בין אלמנטים רגולטוריים דיסטליים לבין המטרות שלהם הן סוג תא וגירוי ספציפיים 21,22, משתרעים על פני מאות קילו-בסיסים, מגשרים על גנים אחרים לכל כיוון 23,24,25, ואפילו יכולים להיות ממוקמים בתוך אזורים אינטרוניים של גן המטרה שלהם או גנים אחרים שאינם מתערבים 26,27. יתר על כן, אלמנטים רגולטוריים דיסטליים יכולים גם לשלוט ביותר מגן אחד בו זמנית, ולהיפך28,29. מורכבות מיקום זו מעכבת איתור קשרים רגולטוריים ביניהם, ולכן רוב המטרות של כל אלמנט רגולטורי בכל סוג תא נותרות בלתי ידועות.

בשנים האחרונות חלה פריחה משמעותית בפיתוח טכניקות לכידת קונפורמציה של כרומוזומים (3C) לחקר אינטראקציות כרומטין. השימוש הנפוץ ביותר בהם, Hi-C, מאפשר ליצור מפה של כל האינטראקציות בין כל קטע של גנוםהתא 30. עם זאת, כדי לזהות אינטראקציות משמעותיות ברמת מקטע ההגבלה, Hi-C מסתמך על ריצוף עמוק במיוחד, ואוסר על השימוש בו כדי לחקור באופן שגרתי את הנוף הרגולטורי של גנים בודדים. כדי להתגבר על מגבלה כלכלית זו, התפתחו מספר טכניקות 3C מבוססות העשרה, כגון ChIA-PET31, HiChIP 32, ומקבילו בעל הקלט הנמוך HiCuT33. טכניקות אלה תלויות בשימוש בנוגדנים להעשרה לאינטראקציות כלל-גנומיות המתווכות על ידי חלבון מסוים. עם זאת, התכונה הייחודית של טכניקות 3C אלה היא גם הנזק של היישום שלהם; המשתמשים סומכים על זמינותם של נוגדנים איכותיים לחלבון המעניין ואינם יכולים להשוות בין מצבים בהם קשירת החלבון היא דינמית.

Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) היא טכניקת 3C מבוססת העשרה נוספת העוקפת מגבלות אלה34,35. על ידי שימוש במערכת העשרת גשושיות RNA ביוטינילציה, PCHi-C מסוגל ליצור ספריות ברזולוציה גבוהה של אזורים גנומיים ברחבי הגנום המקיימות אינטראקציה עם 28,650 מקדמי גנים מבוארים לבני אדם או 27,595 עכברים, הידועים גם בשם אינטראקטום מקדם. גישה זו מאפשרת לזהות אינטראקציות ארוכות טווח משמעותיות ברזולוציית מקטע ההגבלה של מקדמים פעילים ולא פעילים כאחד, ולהשוות באופן יציב אינטראקטומים של מקדמים בין כל תנאי שאינו תלוי בדינמיקה של שינויים בהיסטון או קשירת חלבונים. PCHi-C נמצא בשימוש נרחב בשנים האחרונות כדי לזהות ארגון מחדש של אינטראקטומים במהלך התמיינות תאים 36,37, לזהות את מנגנון הפעולה של גורמי שעתוק38,39, ולגלות גנים ומסלולים פוטנציאליים חדשים שעברו דה-רגולציה במחלה על ידי וריאנטים לא מקודדים 40,41,42,43,44,45,46,47,48, לצד מוטציות לא מקודדות של נהגים חדשים49,50. חוץ מזה, רק על ידי שינוי מערכת לכידה, טכניקה זו יכולה להיות מותאמת אישית על פי השאלה הביולוגית לחקור כל interactome (למשל, interactome משפר 51 או interactome של אוסף של שינויים שאינם קידוד41,52).

עם זאת, PCHi-C מסתמך על מינימום של 20 מיליון תאים כדי לבצע את הטכניקה, אשר מונעת מחקר של אוכלוסיות תאים נדירות כגון אלה המשמשים לעתים קרובות ביולוגיה התפתחותית ויישומים קליניים. מסיבה זו, פיתחנו קלט נמוך Capture Hi-C (liCHi-C), שיטה חדשה חסכונית וניתנת להתאמה אישית המבוססת על מסגרת הניסוי של PCHi-C ליצירת אינטראקטומים מקדמים ברזולוציה גבוהה עם קלט תאים נמוך. על ידי ביצוע הניסוי עם שינויים מינימליים בצינור, החלפה או ביטול של צעדים מפרוטוקול PCHi-C המקורי, הפחתה דרסטית של נפחי התגובה ושינוי ריכוזי ריאגנטים, מורכבות הספרייה היא מקסימלית וניתן ליצור ספריות באיכות גבוהה עם מעט כמו 50,000 תאים53.

לכידת קלט נמוך Hi-C (liCHi-C) נבדקה כנגד PCHi-C ושימשה להבהרת חיווט מחדש של אינטראקטום מקדם במהלך התמיינות תאים המטופויטיים אנושיים, גילוי גנים ומסלולים פוטנציאליים חדשים הקשורים למחלות שאינם מוסדרים על ידי שינויים שאינם מקודדים, וזיהוי הפרעות כרומוזומליות53. פרוטוקול שלב אחר שלב ובקרות האיכות השונות באמצעות הטכניקה מפורטים כאן עד לדור הסופי של הספריות והניתוח החישובי שלהן.

Protocol

כדי להבטיח אובדן חומרים מינימלי, (1) עבוד עם צינורות וקצוות DNA בעלי קישור נמוך (ראה טבלת חומרים), (2) מקם ריאגנטים על דופן הצינור במקום להכניס את הקצה לתוך הדגימה, ו-(3) אם אפשר, ערבב את הדגימה על ידי היפוך במקום להציף את הדגימה למעלה ולמטה, והסתובב למטה לאחר מכן כדי לשחזר את הדגימה. <p cla…

Representative Results

liCHi-C מציעה את האפשרות ליצור ספריות אינטראקטום מקדמי גנום באיכות גבוהה וברזולוציה רחבה עם מעט כמו 50,000 תאים53. הדבר מושג על ידי – מלבד הפחתה דרסטית של נפחי התגובה ושימוש בכלי פלסטיק בעלי קישור נמוך לדנ”א לאורך כל הפרוטוקול – הסרת צעדים מיותרים מהפרוטוקול המקורי, שבהם מתרחשים הפ?…

Discussion

liCHi-C מציעה את היכולת ליצור ספריות אינטראקטום מקדם ברזולוציה גבוהה באמצעות מסגרת ניסויית דומה מזו של PCHi-C, אך עם מספר תאים מופחת במידה ניכרת. זה מושג במידה רבה על ידי ביטול צעדים מיותרים, כגון טיהור פנול והסרת ביוטין. בפרוטוקול Hi-C הקלאסי של קשירת גרעיןHi-C 57 ובטכניקת הנגזרת שלו PCHi-…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לשאר החברים ממעבדת Javierre על המשוב שלהם על כתב היד. אנו מודים לתוכנית CERCA, Generalitat de Catalunya ולקרן Josep Carreras על התמיכה המוסדית. עבודה זו מומנה על ידי פדר / משרד המדע והחדשנות הספרדי (RTI2018-094788-A-I00), האגודה ההמטולוגית האירופית (4823998) והאגודה הספרדית נגד סרטן (AECC) LABAE21981JAVI. BMJ ממומן על ידי פרויקט Junior Leader של קרן הבנקאות La Caixa (LCF / BQ / PI19 / 11690001), LR ממומן על ידי מלגת AGAUR FI (2019FI-B00017), ו- LT-D ממומן על ידי מלגת FPI (PRE2019-088005). אנו מודים לתוכנית הדוקטורט בביוכימיה וביולוגיה מולקולרית מהאוניברסיטה האוטונומית של ברצלונה על תמיכתה. אף אחד מהמממנים לא היה מעורב בשום שלב בעיצוב הניסוי או בכתיבת כתב היד.

Materials

0.4 mM Biotin-14-dATP Invitrogen 19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0 Invitrogen AM9260G
1 M Tris pH 8.0 Invitrogen AM9855G
10x NEBuffer 2 New England Biolabs B7002S Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBS Fisher Scientific BP3994
10x T4 DNA ligase reaction buffer New England Biolabs B0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free Thermo Scientific 28908
20 mg/mL Bovine Serum Albumin New England Biolabs B9000S
5 M NaCl Invitrogen AM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubes Qiuantabio 2302820 For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplification Integrated DNA Technologies Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappers Nunc 179693 Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes) Any brand
CHiCAGO R package 1.14.0
CleanNGS beads CleanNA CNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTP Promega U120A, U121A, U122A, U123A Or any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mL Eppendorf 30108051
DNA LoBind tube, 2 mL Eppendorf 30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL New England Biolabs M0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads Invitrogen 65002 For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads Invitrogen 65602 For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2 Invitrogen 12321D Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absolute VWR 20821.321
FBS, qualified Gibco 10270-106 Or any other brand
Glycine Fisher BioReagents BP381-1
GlycoBlue Coprecipitant Invitrogen AM9515 Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP 0.8.2
HindIII, 100 U/µL New England Biolabs R0104T
IGEPAL CA-630 Sigma-Aldrich I8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mL New England Biolabs M0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL) ZeroTip PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicator Covaris 500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials Covaris 520045 For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µL New England Biolabs R3131M
Nuclease-free molecular biology grade water Sigma-Aldrich W4502
PCR primers for quality controls Integrated DNA Technologies
PCR strips and caps Agilent Technologies 410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA Sigma-Aldrich P3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531L For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) Roche 11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR grade Roche 3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit Invitrogen Q33230 For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubes Invitrogen Q32856
rCutsmart buffer New England Biolabs B6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX Gibco 61870-010 Or any other brand
SDS – Solution 10% for molecular biology PanReac AppliChem A0676
Sodium acetate pH 5.2 Sigma-Aldrich S7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb library Agilent Technologies 5190-4831 Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1 Agilent Technologies 5190-8645 Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter Agilent Technologies 931107 Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µL Invitrogen 15224025 For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mL New England Biolabs M0202T For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mL New England Biolabs M0203L
T4 PNK 10000 units/mL New England Biolabs M0201L
Tapestation 4200 instrument Agilent Technologies For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11
(Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagents Agilent Technologies 5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585, For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11
(Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biology PanReac AppliChem A4975
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416-50ML

References

  1. Hatton, C. S., et al. α-thalassemia caused by a large (62 kb) deletion upstream of the human α globin gene cluster. Blood. 76 (1), 221-227 (1990).
  2. Toikkanen, S., Helin, H., Isola, J., Joensuu, H. Prognostic significance of HER-2 oncoprotein expression in breast cancer: A 30-year follow-up. Journal of Clinical Oncology. 10 (7), 1044-1048 (1992).
  3. Church, C., et al. Overexpression of Fto leads to increased food intake and results in obesity. Nature Genetics. 42 (12), 1086-1092 (2010).
  4. Bhatia, S., et al. Disruption of autoregulatory feedback by a mutation in a remote, ultraconserved PAX6 enhancer causes aniridia. American Journal of Human Genetics. 93 (6), 1126-1134 (2013).
  5. Herranz, D., et al. A NOTCH1-driven MYC enhancer promotes T cell development, transformation and acute lymphoblastic leukemia. Nature Medicine. 20 (10), 1130-1137 (2014).
  6. Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. Long-range chromatin regulatory interactions in vivo. Nature Genetics. 32 (4), 623-626 (2002).
  7. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  8. Schoenfelder, S., Fraser, P. Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control. Nature Reviews Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).
  9. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
  10. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Research. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  11. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  12. McPherson, C. E., Shim, E. Y., Friedman, D. S., Zaret, K. S. An active tissue-specific enhancer and bound transcription factors existing in a precisely positioned nucleosomal array. Cell. 75 (2), 387-398 (1993).
  13. He, A., Kong, S. W., Ma, Q., Pu, W. T. Co-occupancy by multiple cardiac transcription factors identifies transcriptional enhancers active in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (14), 5632-5637 (2011).
  14. Dogan, N., et al. Occupancy by key transcription factors is a more accurate predictor of enhancer activity than histone modifications or chromatin accessibility. Epigenetics and Chromatin. 8, 16 (2015).
  15. Whyte, W. A., et al. transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  16. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  17. He, H. H., et al. Nucleosome dynamics define transcriptional enhancers. Nature Genetics. 42 (4), 343-347 (2010).
  18. Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
  19. De Santa, F., et al. A large fraction of extragenic RNA Pol II transcription sites overlap enhancers. PLoS Biology. 8 (5), e1000384 (2010).
  20. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  21. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  22. Wu, H., et al. Tissue-specific RNA expression marks distant-acting developmental enhancers. PLoS Genetics. 10 (9), e1004610 (2014).
  23. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  24. Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Developmental Cell. 16 (1), 47-57 (2009).
  25. Shi, J., et al. Role of SWI/SNF in acute leukemia maintenance and enhancer-mediated Myc regulation. Genes and Development. 27 (24), 2648-2662 (2013).
  26. Lettice, L. A., et al. A long-range Shh enhancer regulates expression in the developing limb and fin and is associated with preaxial polydactyly. Human Molecular Genetics. 12 (14), 1725-1735 (2003).
  27. Tuvikene, J., et al. Intronic enhancer region governs transcript-specific Bdnf expression in rodent neurons. eLife. 10, e65161 (2021).
  28. Tasic, B., et al. Promoter choice determines splice site selection in protocadherin α and γ pre-mRNA splicing. Molecular Cell. 10 (1), 21-33 (2002).
  29. Perry, M. W., Boettiger, A. N., Levine, M. Multiple enhancers ensure precision of gap gene-expression patterns in the Drosophila embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (33), 13570-13575 (2011).
  30. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  31. Fullwood, M. J., et al. An oestrogen-receptor-α-bound human chromatin interactome. Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).
  32. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: Efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).
  33. Sati, S., et al. HiCuT: An efficient and low input method to identify protein-directed chromatin interactions. PLoS Genetics. 18 (3), e1010121 (2022).
  34. Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
  35. Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter capture Hi-C: High-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
  36. Rubin, A. J., et al. Lineage-specific dynamic and pre-established enhancer-promoter contacts cooperate in terminal differentiation. Nature Genetics. 49 (10), 1522-1528 (2017).
  37. Siersbæk, R., et al. Dynamic rewiring of promoter-anchored chromatin loops during adipocyte differentiation. Molecular Cell. 66 (3), 420-435 (2017).
  38. Schoenfelder, S., et al. Polycomb repressive complex PRC1 spatially constrains the mouse embryonic stem cell genome. Nature Genetics. 47 (10), 1179-1186 (2015).
  39. Zhang, N., et al. Muscle progenitor specification and myogenic differentiation are associated with changes in chromatin topology. Nature Communications. 11 (1), 6222 (2020).
  40. Javierre, B. M., et al. Lineage-specific genome architecture links enhancers and non-coding disease variants to target gene promoters. Cell. 167 (5), 1369-1384 (2016).
  41. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nature Communications. 6, 6178 (2015).
  42. Martin, P., et al. Identifying causal genes at the multiple sclerosis associated region 6q23 using capture Hi-C. PLoS One. 11 (11), e0166923 (2016).
  43. Burren, O. S., et al. Chromosome contacts in activated T cells identify autoimmune disease candidate genes. Genome Biology. 18 (1), 165 (2017).
  44. Choy, M. K., et al. Promoter interactome of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes connects GWAS regions to cardiac gene networks. Nature Communications. 9 (1), 2526 (2018).
  45. Miguel-Escalada, I., et al. Human pancreatic islet three-dimensional chromatin architecture provides insights into the genetics of type 2 diabetes. Nature Genetics. 51 (7), 1137-1148 (2019).
  46. Law, P. J., et al. Association analyses identify 31 new risk loci for colorectal cancer susceptibility. Nature Communications. 10 (1), 2154 (2019).
  47. Speedy, H. E., et al. Insight into genetic predisposition to chronic lymphocytic leukemia from integrative epigenomics. Nature Communications. 10 (1), 3615 (2019).
  48. Li, T., et al. Epigenomics and transcriptomics of systemic sclerosis CD4+ T cells reveal long-range dysregulation of key inflammatory pathways mediated by disease-associated susceptibility loci. Genome Medicine. 12 (1), 81 (2020).
  49. Orlando, G., et al. Promoter capture Hi-C-based identification of recurrent noncoding mutations in colorectal cancer. Nature Genetics. 50 (10), 1375-1380 (2018).
  50. Cornish, A. J., et al. Identification of recurrent noncoding mutations in B-cell lymphoma using capture Hi-C. Blood Advances. 3 (1), 21-32 (2019).
  51. Madsen, J. G. S., et al. Highly interconnected enhancer communities control lineage-determining genes in human mesenchymal stem cells. Nature Genetics. 52 (11), 1227-1238 (2020).
  52. Dryden, N. H., et al. Unbiased analysis of potential targets of breast cancer susceptibility loci by Capture Hi-C. Genome Research. 24 (11), 1854-1868 (2014).
  53. Tomás-Daza, L., et al. Low input capture Hi-C (liCHi-C) identifies promoter-enhancer interactions at high-resolution. Nature Communications. 14 (1), 268 (2023).
  54. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. 62 (62), e3923 (2012).
  55. Bronner, I. F., Quail, M. A. Best practices for Illumina library preparation. Current Protocols in Human Genetics. 102 (1), 86 (2019).
  56. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000Research. 4, 1310 (2015).
  57. Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16 (1), 175 (2015).
  58. Cairns, J., et al. CHiCAGO: Robust detection of DNA looping interactions in Capture Hi-C data. Genome Biology. 17 (1), 127 (2016).
  59. Freire-Pritchett, P., et al. Detecting chromosomal interactions in Capture Hi-C data with CHiCAGO and companion tools. Nature Protocols. 16 (9), 4144-4176 (2021).
  60. Kihm, A. J., et al. An abundant erythroid protein that stabilizes free α-haemoglobin. Nature. 417 (6890), 758-763 (2002).
  61. Feng, L., et al. Molecular mechanism of AHSP-mediated stabilization of α-hemoglobin. Cell. 119 (5), 629-640 (2004).
  62. Favero, M. E., Costa, F. F. Alpha-hemoglobin-stabilizing protein: An erythroid molecular chaperone. Biochemistry Research International. 2011, 373859 (2011).
  63. Li, D., et al. WashU Epigenome Browser update 2022. Nucleic Acids Research. 50 (W1), W774-W781 (2022).
  64. Mifsud, B., et al. Mapping long-range promoter contacts in human cells with high-resolution capture Hi-C. Nature Genetics. 47 (6), 598-606 (2015).
  65. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502 (7469), 59-64 (2013).
  66. Tan, L., Xing, D., Chang, C. H., Li, H., Xie, X. S. 3D genome structures of single diploid human cells. Science. 361 (6405), 924 (2018).
  67. Ramani, V., et al. Massively multiplex single-cell Hi-C. Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).
  68. Díaz, N., et al. Chromatin conformation analysis of primary patient tissue using a low input Hi-C method. Nature Communications. 9 (1), 4938 (2018).
  69. Lu, L., Jin, F. Easy Hi-C: A low-input method for capturing genome organization. Methods in Molecular Biology. 2599, 113-125 (2023).

Play Video

Cite This Article
Rovirosa, L., Tomás-Daza, L., Urmeneta, B., Valencia, A., Javierre, B. M. An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations. J. Vis. Exp. (194), e65316, doi:10.3791/65316 (2023).

View Video