本文描述了一种使用基于光学的平台在人诱导的多能干细胞衍生心肌细胞中进行收缩性和钙测量的既定方法。该平台使研究人员能够以快速且可重复的方式研究突变的影响以及对各种刺激的反应。
人诱导的多能干细胞衍生心肌细胞(hiPSC-CMs)是研究突变介导的心肌细胞功能变化以及确定应激源和药物干预效果的有力工具。在这项研究中,证明了这种基于光学的系统是评估2D中hiPSC-CMs功能参数的有力工具。通过使用该平台,可以在保存完好的温度环境中对不同的板布局进行配对测量。此外,该系统为研究人员提供了即时数据分析。
本文描述了一种测量未修饰的hiPSC-CMs收缩力的方法。在37°C下测量收缩动力学,基于相对于在250 Hz采样频率下弛豫时拍摄的参考帧的像素相关性变化。此外,可以通过用钙敏感荧光团(如Fura-2)加载细胞来同时测量细胞内钙瞬变。使用超开关,可以在直径为50μm的照明点上进行比例钙测量,对应于收缩性测量的面积。
心力衰竭是全世界死亡的主要原因。2019年,心血管疾病在全球造成1860万人死亡,比过去十年增加了17.1%1。尽管研究人员努力确定预防和治疗心力衰竭的药物靶点,但患者的预后仍然很差2。动物模型相对于人类的病理生理学差异可能是心力衰竭治疗优化成功有限的潜在因素之一3。需要额外的类人模型来模拟疾病并测试新型药物化合物的毒性和有效性。
人诱导的多能干细胞来源心肌细胞(hiPSC-CMs)是确定应激源、缺血、代谢改变或致病基因变异诱导的细胞病理机制以及药物干预的有效性和毒性的有力工具4。为了确定对hiPSC-CMs功能特性的影响,需要一种高速系统,以无偏和可重复的方式测量细胞收缩的收缩和舒张特性。当前研究的总体目标是证明基于光学的系统是对hiPSC-CMs的功能参数进行实时分析的强大工具。
目前,有多个平台可以评估hiPSC-CMs的收缩性。然而,目前的系统要么读数慢,要么所需的细胞数量可能是一个挑战。无标签视频测量系统5、6 依赖于对视频的事后分析,这需要大量的存储空间,并且在视频采集过程中缺乏直接反馈。此外,很难实现足够的时间和空间分辨率,并可能导致欠采样。确定心肌细胞特性的其他方法,例如带有荧光报告基因的成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/ Cas9编辑的hiPSC-CMs7 可能会干扰细胞的基因稳定性,并且需要专门的实验室专业知识。
为了克服上述限制,本研究开发并引入了一种独特的基于光学的测量系统。该平台只需在任何所需的板格式上重新镀层,即可对未修饰的hiPSC-CM进行收缩性测量,而不受板尺寸限制。此外,实时测量允许直接观察和分析hiPSC-CMs的功能参数,从而提供即时调整和优化方案的实验设置。此外,每个测量的位置都被存储,这使得可以对同一样品进行配对测量,从而提高实验的能力。
为了演示基于光学的系统,在对照hiPSC-CM生产线上进行了收缩性测量。该对照hiPSC系由具有正常核型8的健康男性供体的真皮成纤维细胞产生。在37 °C下测量收缩动力学,基于在250 Hz采样频率下弛豫期间相对于参考系的像素相关性变化。由于收缩的确切开始并不总是明确确定的,因此将达到峰值高度的20%的时间点(到峰值的时间20%)作为测量峰值时间的起点。通过这样做,在一个样本中发现该参数的变异性较小。同样,由于难以评估信号返回基线的确切时刻,因此使用从峰值达到基线返回基线的80%(到基线的时间80%)来描述松弛时间。
总体收缩性测量包括静息跳动频率,从20%峰值到峰值收缩的时间(TP.Con),以及从峰值收缩到基线80%的时间(TB.骗局80)(图1B)。为了测试应激源的效果,将细胞与异丙肾上腺素(ISO)一起孵育。此外,与收缩性测量巧合的是,通过在250 Hz的采样频率下加载Fura-2-乙酰氧基甲酯(Fura-2 AM)来测量Ca2 +瞬变。 使用超开关的比例Ca2+测量9在直径为50μm的照明区域上进行,对应于收缩性测量的区域。Ca 2+测量数据表示为Ca2+瞬态(TP.Ca)中从20%峰到峰的时间,以及从峰值到基线80%的时间(TB.Ca80)(图1C)。使用快速、自动的数据分析工具来生成每个区域的平均收缩和钙动力学参数。
在这项研究中,描述了一种对hiPSC-CMs进行收缩力和钙瞬时测量的方法,并研究应激源/药物对这些细胞的影响。收缩性测量,比例钙测量和对ISO的反应在三轮不同的分化中进行,作为生物学重复。对于每个生物重复,在三个孔上进行测量作为技术重复。以这种方式进行测量的原因是为了确保可以评估样品和平台的生物变异性和技术变异性。除了考虑适当数量的生物学和技术重复外,hiPSC-CM培养条件对于获得持续和可靠的结果可以发挥重要作用。在测量过程中,必须符合标准,例如hiPSC-CMs的年龄、培养基的组成、重铺条件和化合物孵育时间。在这项研究中,在一个井中两次测量11个区域,每次10秒,平均需要568±24秒。这包括 79 ± 11 秒的 ISO 孵育时间。这归结为每孔大约 10 分钟,这应该使研究人员能够在 ~4 小时内测量完整的 24 孔板。气候控制用于保持稳定的CO2。这允许以高速方式测量化合物/应激源对hiPSC-CM的影响。
为了测量iPSC-CMs的收缩功能,有几种现有的系统依赖于光遗传学13或无标记视频显微镜5,6。光遗传学系统非常复杂,需要特殊技术才能获得电物理和/或收缩力数据。其他系统依赖于视频的事后分析,这需要大量的存储空间,并且在视频采集过程中缺乏直接反馈。此外,很难实现足够的时间和空间分辨率,这可能会导致欠采样。同样,带有荧光报告基因7的CRISPR / CAS-9编辑的hiPSC-CMs可能会对心肌细胞行为产生不良影响。使用荧光染料进行收缩-弛豫测量也是一种优雅的方法,但限制了对同一样品进行较长时间的实验14。
然而,这种基于光学的测量平台可用于测量收缩-弛豫时间,而无需使用任何荧光染料或侵入性方法。然而,由于像素相关性不能提供空间信息,该方法不能用于测量收缩强度,而只能可靠地检测收缩和松弛速度的变化。引入的测量系统是温度控制的,可以以每秒>200帧的分辨率实时获取钙和收缩力数据。此外,每个测量的位置都被存储,这使得配对测量成为可能,从而提高实验的能力。此外,该平台为研究人员提供了存储数据并在实验后立即分析数据的能力。总体而言,这种基于光学的测量系统被证明是研究细胞病理机制的一种有前途的方法,可以评估化合物对hiPSC-CMs功能的影响,并且有助于药物筛选的临床前过程。
The authors have nothing to disclose.
这项研究部分由Eurostars grant Estars2 113937 CARDIOMYO(EM&DK)和NWO-VICI grant 91818602(JV)资助。
µ-Plate 24 Well Black ID 14 mm | ibidi | 82421 | |
B-27 Supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | |
CytoSolver transient analysis tool | CytoCypher | A fast automatic data analysis tool | |
DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 11320033 | |
Fura-2, AM | Thermo Fisher | F1221 | |
Isoprenaline hydrochloride | Merck | 15627 | |
KnockOut™ Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828010 | |
Matrigel | Merck | CLS3542C | Basement membrane |
MultiCell CytoCypher with Nikon 20x Super Fluor objective and 730 nm LED light source and Ionwizard software | CytoCypher | Optics-based measurement system | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
RPMI 1640 | Thermo Fisher | 11875119 | |
Tyrode | Self-made solution with final concentration of the following components: NaCl 134 mM, KCl 5 mM, Hepes 12 mM, MgSO4 1.2 mM, NaH2PO4 H2O 1.2 mM, Glucose 11 mM, Sodium Pyrovate 5 mM, 1 mM CaCl2 |