감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 쥐 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교 세포 배양 확립
Summary
이 프로토콜은 신경(면역)학 연구를 위해 배아 17일 마우스 뇌에서 중추 신경계 세포 배양을 생성하는 독특한 방법을 제시합니다. 이 모델은 RT-qPCR, 현미경, ELISA 및 유세포 분석을 포함한 다양한 실험 기술을 사용하여 분석할 수 있습니다.
Abstract
중추신경계(CNS)의 모델은 생체 내에서 발견되는 상호 연결된 세포의 복잡한 네트워크를 요약해야 합니다.중추신경계는 주로 뉴런, 성상교세포, 희소돌기아교세포 및 미세아교세포로 구성됩니다. 동물 사용을 대체하고 줄이기 위한 노력이 증가함에 따라 선천성 세포 특성을 탐색하기 위해 다양한 시험관 내 세포 배양 시스템이 개발되어 CNS 감염 및 병리에 대한 치료제를 개발할 수 있습니다. 특정 연구 질문은 (유도된) 만능 줄기 세포와 같은 인간 기반 세포 배양 시스템으로 해결할 수 있지만 인간 세포로 작업하는 것은 가용성, 비용 및 윤리와 관련하여 고유한 한계가 있습니다. 여기에서는 배아 마우스 뇌에서 세포를 분리하고 배양하기 위한 고유한 프로토콜을 설명합니다. 그 결과 혼합 신경 세포 배양은 생체 내 뇌에서 발견되는 여러 세포 집단과 상호 작용을 모방합니다. 현재의 동등한 방법과 비교할 때, 이 프로토콜은 뇌의 특성을 더 밀접하게 모방하고 더 많은 세포를 확보하므로 임신한 마우스 한 마리에서 더 많은 실험 조건을 조사할 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 비교적 쉽고 재현성이 높습니다. 이러한 배양은 96웰 기반 고처리량 스크리닝, 24웰 현미경 분석, 유세포 분석 및 역전사 정량 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR) 분석을 위한 6웰 배양을 포함하여 다양한 규모로 사용하도록 최적화되었습니다. 이 배양 방법은 시험관 내 방법의 편리함과 함께 CNS의 일부 복잡성의 맥락에서 감염 및 면역을 조사하는 강력한 도구입니다.
Introduction
중추신경계(CNS)에 대한 이해를 높이는 것은 많은 신경염증 및 신경퇴행성 질환에 대한 치료 옵션을 개선하는 데 중요합니다. 뇌, 척수, 시신경 내에서 상호 연결된 세포의 복잡한 네트워크인 CNS는 뉴런, 희소돌기아교세포, 성상교세포 및 이들의 선천성 면역 세포인 미세아교세포로 구성됩니다1. 체외 접근법은 종종 의미있는 연구를 수행하는 데 필요한 마우스의 수를 크게 줄일 수 있습니다. 그러나 CNS의 복잡한 특성으로 인해 세포주를 사용하여 생체 내 상황을 요약하는 것은 불가능합니다. 혼합 신경 세포 배양은 3Rs(Replacement, Reduction and Refinement) 원칙 2,3에 따라 관련 모델에서 신경(면역학) 문제를 조사하는 데 매우 유용한 연구 도구를 제공합니다.
Thomson et al.은 앞서 언급한 모든 주요 CNS 세포 유형으로 분화하는 태아기 척수 세포를 이용한 세포 배양 방법을 설명했다4. 이 시스템은 또한 시냅스 형성, 수초 축삭 및 Ranvier의 노드를 가지고 있습니다. 이 배양 방법의 주요 한계는 척수이기 때문에 뇌를 유용하게 모델링하지 못하고 배아 13일(E13) 척수로부터의 세포 수율이 수축한다는 것입니다. 따라서 조사할 수 있는 실험 조건의 수가 제한됩니다. 따라서 본 연구는 동물에 대한 요구량을 줄이기 위해 세포 수율이 증가한 뇌의 특성을 재현하는 새로운 세포 배양 시스템을 개발하는 것을 목표로 했습니다.
Thomson et al. 출발점으로 우리는 순전히 태아기 쥐의 뇌에서 파생된 세포 배양 모델을 개발했습니다. 이러한 배양은 척수 배양과 동일한 세포 집단, 상호 연결성 및 치료 옵션을 가지고 있지만 비교에 의한 수초화가 적습니다. 그러나 세포 수율이 약 3배 더 높은 CNS in vitro 모델을 갖는 것이 더 효율적이며, 더 적은 수의 마우스와 더 적은 배아 처리 시간을 필요로 합니다. 당사는 현미경 분석을 위한 유리 커버슬립과 고처리량 연구를 위한 96웰 플레이트를 포함한 다양한 크기의 플라스틱 웰 플레이트를 사용하는 등 여러 다운스트림 응용 분야 및 스케일에 맞게 이 고유한 배양 시스템을 최적화했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
중추신경계는 뇌에서 척수까지 이어지는 복잡한 네트워크로, 주로 뉴런, 희소돌기아교세포, 성상교세포, 미세아교세포 등 다양한 세포 유형으로 구성되어 있다1. 각 세포는 항상성을 유지하고 CNS 9,10,11의 문제에 대한 적절한 반응을 생성하는 데 중요한 역할을 하기 때문에 이러한 모든 세포 유형을 포함하는 배양 시스템은 뇌?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Edgar 및 Linington 연구소 구성원, 특히 Chris Linington 교수, Diana Arseni 박사 및 Katja Muecklisch 박사에게 이러한 문화를 설정하는 동안 문화에 대한 조언, 유용한 의견 및 지원에 감사드립니다. Cell Profiler 파이프라인의 시작점을 제공한 Dr Muecklisch에게 특별한 감사를 전합니다. 이 작업은 MS Society (보조금 122)와 Yuri and Lorna Chernajovsky 재단의 지원을 받았습니다. JC 및 MP에 대한 글래스고 대학교 자금 지원; 및 Wellcome Trust(217093/Z/19/Z) 및 Medical Research Council(MRV0109721)을 GJG에 제공합니다.
Materials
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
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