Perfusão de máquina hepática normotérmica ex vivo em camundongos
Summary
Um sistema normotérmico ex vivo de perfusão hepática (NEVLP) foi criado para fígados de camundongos. Este sistema requer experiência em microcirurgia, mas permite resultados reprodutíveis de perfusão. A capacidade de utilizar fígados de camundongos facilita a investigação de vias moleculares para identificar novos aditivos de perfusato e permite a execução de experimentos focados no reparo de órgãos.
Abstract
Este protocolo apresenta um sistema NEVLP livre de eritrócitos otimizado usando fígados de camundongos. A preservação ex vivo de fígados de camundongos foi obtida empregando-se cânulas modificadas e técnicas adaptadas de equipamentos comerciais convencionais de perfusão ex vivo . O sistema foi utilizado para avaliar os resultados de preservação após 12 h de perfusão. Camundongos C57BL/6J serviram como doadores de fígado, e os fígados foram explantados canulando a veia porta (VP) e o ducto biliar (BD) e, posteriormente, lavando o órgão com solução salina heparinizada aquecida (37 °C). Em seguida, os fígados explantados foram transferidos para a câmara de perfusão e submetidos à máquina de perfusão oxigenada normotérmica (NEVLP). Amostras de perfusato de entrada e saída foram coletadas em intervalos de 3 h para análise do perfusato. Ao término da perfusão, amostras de fígado foram obtidas para análise histológica, com integridade morfológica avaliada pelo Suzuki-Score modificado através da coloração pela Hematoxilina-Eosina (HE). Os experimentos de otimização produziram os seguintes achados: (1) camundongos pesando mais de 30 g foram considerados mais adequados para o experimento devido ao maior tamanho de seu ducto biliar (BD). (2) uma cânula de poliuretano 2 Fr (diâmetro externo = 0,66 mm) foi mais adequada para canulação da veia porta (VP) quando comparada a uma cânula de polipropileno. Isso foi atribuído à maior aderência do material de poliuretano, resultando em menor deslizamento do cateter durante a transferência do corpo para a câmara do órgão. (3) para a canulação do ducto biliar (BD), uma cânula de poliuretano 1 Fr (diâmetro externo = 0,33 mm) mostrou-se mais eficaz em comparação com a cânula de polipropileno UT – 03 (diâmetro externo = 0,30 mm). Com este protocolo otimizado, fígados de camundongos foram preservados com sucesso por uma duração de 12 h sem impacto significativo na estrutura histológica. A coloração pela hematoxilina-eosina (HE) revelou uma arquitetura morfológica do fígado bem preservada, caracterizada por hepatócitos predominantemente viáveis com núcleos claramente visíveis e discreta dilatação dos sinusóides hepáticos.
Introduction
O transplante hepático representa o tratamento padrão-ouro para indivíduos com doença hepática terminal. Lamentavelmente, a demanda por órgãos de doadores supera a oferta disponível, levando a uma escassez significativa. Em 2021, aproximadamente 24.936 pacientes estavam na lista de espera por um enxerto de fígado, enquanto apenas 9.234 transplantes foram realizados com sucesso1. A significativa disparidade entre a oferta e a demanda de enxertos hepáticos destaca a necessidade premente de investigar estratégias alternativas para ampliar o pool de doadores e melhorar a acessibilidade dos enxertos hepáticos. Uma forma de ampliar o pool de doadores é utilizar doadores marginais2. Os doadores marginais incluem aqueles com idade avançada, esteatose moderada ou grave. Embora o transplante de órgãos marginais possa produzir resultados favoráveis, os resultados gerais permanecem subótimos. Como resultado, o desenvolvimento de estratégias terapêuticas que visem melhorar a função de doadores marginais está atualmente em andamento 3,4.
Uma das estratégias é utilizar a máquina de perfusão, especialmente a máquina de oxigenação normotérmica, para melhorar a função desses órgãos marginais5. No entanto, ainda há uma compreensão limitada dos mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos benéficos da perfusão de máquina oxigenada normotérmica (NEVLP). Camundongos, com sua abundante disponibilidade de cepas geneticamente modificadas, servem como modelos valiosos para a investigação de vias moleculares. Por exemplo, a importância das vias de autofagia na atenuação da lesão de isquemia-reperfusão hepática tem sido cada vez maisreconhecida6,7. Uma importante via molecular na lesão de isquemia-reperfusão hepática éa via miR-20b-5p/ATG78. Atualmente, há uma série de linhagens de camundongos knockout e knock-out condicional disponíveis para ATG, mas nenhuma cepa de rato correspondente9.
Com base nesse contexto, o objetivo foi gerar uma plataforma NEVLP miniaturizada para enxertos hepáticos de camundongos. Essa plataforma facilitaria a exploração e avaliação de potenciais estratégias geneticamente modificadas destinadas a melhorar a funcionalidade do fígado do doador. Além disso, era essencial que o sistema fosse adequado para perfusão a longo prazo, possibilitando o tratamento ex vivo do fígado, comumente referido como “reparo de órgãos”.
Considerando a disponibilidade limitada de dados in vitro relevantes sobre a perfusão hepática em camundongos, a revisão da literatura concentrou-se em estudos realizados em ratos. Uma busca sistemática da literatura de 2010 a 2022 foi realizada usando palavras-chave como “normothermic liver perfusion”, “ex vivo or in vitro” e “rats“. Esta pesquisa teve como objetivo identificar condições ótimas em roedores, permitindo determinar a abordagem mais adequada.
O sistema de perfusão consiste de um reservatório tampão de vidro vedado com camisa d’água, uma bomba de rolos peristálticos, um oxigenador, um coletor de bolhas, um trocador de calor, uma câmara de órgãos e um sistema fechado de tubos de ciclagem (Figura 1). O sistema garante a manutenção precisa de uma temperatura de perfusão constante de 37 °C usando uma máquina termostática dedicada. A bomba de rolos peristálticos conduz o fluxo do perfusato por todo o circuito. O circuito de perfusão inicia-se no reservatório isolado encamisado de água. Posteriormente, o perfusato é direcionado através do oxigenador, que recebe uma mistura gasosa de 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono de uma garrafa de gás dedicada. Após a oxigenação, o perfusato passa através da armadilha de bolhas, na qual quaisquer bolhas aprisionadas são redirecionadas de volta para o reservatório pela bomba peristáltica. O perfusato remanescente flui através do trocador de calor e entra na câmara do órgão, de onde retorna ao reservatório.
Aqui, relatamos nossas experiências no estabelecimento de uma NEVLP para fígados de camundongos e compartilhamos os resultados promissores de um experimento piloto realizado usando o meio oxigenado sem carreadores de oxigênio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Etapas críticas do protocolo
As duas etapas cruciais no explante hepático são a canulação da veia porta (VP) e a subsequente canulação do ducto biliar (BD). Essas etapas são de suma importância para garantir o sucesso da recuperação de órgãos e subsequentes procedimentos de perfusão ou transplante.
Desafios e soluções
A canulação das VVPP apresenta três desafios: lesão da parede do vaso, deslocamento do cateter e praticabilidade do pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ao longo da redação deste artigo, recebi muito apoio e assistência. Eu particularmente gostaria de agradecer ao meu companheiro de equipe XinPei Chen por sua maravilhosa colaboração e apoio ao paciente durante minha operação.
Materials
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100×15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT – 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
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