الكشف عن الأجسام المضادة لداء IgG و IgM باستخدام اختبار الأجسام المضادة الفلورية غير المباشرة لداء
Summary
الهدف من هذه المخطوطة هو فحص استخدام اختبار الأجسام المضادة الفلورية غير المباشرة لداء للكشف عن الأجسام المضادة IgG و IgM الخاصة بداء.
Abstract
تم تطوير اختبار الأجسام المضادة الفلورية غير المباشرة لداء (IFA) للكشف عن مختلف أنماط الأجسام المضادة الخاصة بداء في الأمصال أو السائل الشوكي الدماغي. يوفر هذا الاختبار نتائج سريعة ويمكن استخدامه للكشف عن الأجسام المضادة لداء في عدة سيناريوهات مختلفة. يعد اختبار IFA لداء مفيدا بشكل خاص للكشف السريع والمبكر عن الأجسام المضادة لتقييم الاستجابة المناعية لدى المريض الذي أصيب بداء. على الرغم من أن الطرق الأخرى لتشخيص داء قبل الوفاة لها الأسبقية ، يمكن استخدام هذا الاختبار لإثبات التعرض الأخير لفيروس داء من خلال اكتشاف الأجسام المضادة. لا يوفر اختبار IFA عيار الأجسام المضادة المعادلة للفيروس (VNA) ، ولكن يمكن تقييم استجابة الوقاية قبل التعرض (PrEP) من خلال وجود الأجسام المضادة الإيجابية أو السلبية. يمكن استخدام هذا الاختبار في مواقف مختلفة ويمكن أن يوفر نتائج لعدد من الأهداف المختلفة. في هذه الدراسة ، استخدمنا العديد من عينات المصل المقترنة من الأفراد الذين تلقوا PrEP وأظهروا وجود الأجسام المضادة لداء بمرور الوقت باستخدام اختبار IFA.
Introduction
يستخدم اختبار الأجسام المضادة الفلورية غير المباشرة لداء (IFA) للكشف عن مختلف أنماط الأجسام المضادة الخاصة بداء في الأمصال أو السائل الدماغي الشوكي. وهو واحد من ترسانة من الاختبارات المتاحة لمراقبة مريض داء قبل الوفاة. من المفيد بشكل خاص للكشف المبكر عن الأجسام المضادة تقييم الاستجابة المناعية للمريض لعدوى داء. عند استخدامه بالاقتران مع اختبارات أخرى وتاريخ الحالة وحالة تطعيم المريض ، يمكن أن يساعد اختبار IFA في تحديد التعرض لفيروس داء أو اللقاح1. نظرا لأن اختبار IFA يقيس IgM و / أو IgG ، يمكن أن تشير قيم الجسم المضاد المحدد إلى إطار زمني تقريبي من التعرض للمستضد1. قد يكون هذا الاختبار مفيدا في التطبيقات المدرجة أو غيرها من التطبيقات التي لم يتم استكشافها بعد.
هناك العديد من المقايسات المصلية لداء المتاحة. اختبار تثبيط التركيز الفلوري السريع (RFFIT) ، أو اختبار تحييد فيروس الأجسام المضادة الفلورية (FAVN) ، أو تعديلات هذه هي الطرق الأساسية لقياس الأجسام المضادة المعادلة لفيروس داء (RVNAs) 1. ومع ذلك ، فإن هذه الاختبارات لا تفرق بين الأجسام المضادة IgM و IgG. عندما يكون التمييز بين النمط المتماثل للأجسام المضادة مهما في مراقبة الاستجابة المناعية لداء ، يتم استخدام اختبارات IFA لداء ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم داء (ELISA) ، لكنها لا تقيس RVNAs. على الرغم من أنه يمكن استخدام اختبارات IFA و ELISA لتحديد وجود أجسام مضادة خاصة بداء في عينة ، إلا أن هناك بعض الاختلافات في كيفية تنفيذها. يستخدم اختبار IFA فيروسا حيا مستزرعا بالخلايا كركيزة مستضد ، بينما يستخدم ELISA النموذجي للكشف عن داء واحدا أو أكثر من البروتينات الفيروسية. في بيئة معملية حيث يمكن زراعة فيروس داء ، يمكن إجراء اختبار IFA بسهولة أكبر بدلا من شراء أو زراعة بروتينات فيروسية فردية ل ELISA. يجب مراعاة الغرض من الاختبار والمعلومات التي تم الحصول عليها من نتائج أي مقايسة مصلية لداء عند تحديد أيهما تختار2.
IgM هو أول من يستجيب ، ويزداد حتى يتم ملاحظة تبديل الفصل في حوالي اليوم 28 ، وعند هذه النقطة يصبح IgG الجسم المضاد السائدالمنتشر 3. وبالتالي ، لن يتوقع IgM إلا لفترة محدودة من الوقت بعد التعرض لفيروس داء أو التطعيم. يمكن أن يشير اختبار كل من المصل والسائل النخاعي (CSF) إلى ما إذا كان التعرض من خلال التطعيم ، حيث يمكن رؤية الأجسام المضادة فقط في الأمصال ، أو من عدوى فيروسية ، والتي من المحتمل أن تظهر أجساما مضادة في السائل الدماغي الشوكي1.
لقد ثبت أن الأجسام المضادة لداء تستمر لعدة سنوات بعد العلاج الوقائي قبل التعرض (PrEP)4. يمكن أن يكون اختبار IFA أداة مفيدة لإثبات ذلك في نقاط زمنية مختلفة بعد التطعيم أو التعرض.
Protocol
Representative Results
Discussion
يستفيد اختبار IFA من مركب الأجسام المضادة للمستضد ، مما يسمح بموقع وضع العلامات لتصور الأجسام المضادة الخاصة بداء. يتم زرع خلايا الورم الأرومي العصبي أو خلايا BHK على شرائح مجهرية متعددة الآبار مغلفة ب PTFE ويتم تلقيحها بسلالة مختبر فيروس داء CVS-11. بمجرد أن تتلاقى الطبقة الأحادية وتصل الخلايا إ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون لمركز وادزورث التابع لوزارة الصحة بولاية نيويورك لدعم هذا المشروع.
Materials
| 25x55mm glass cover slips | Any | ||
| Acetone | Any | ||
| Anti-Human IgG Labeled Conjugate | Sigma-Aldrich | F9512 | |
| Anti-Human IgM Labeled Conjugate | SeraCare | 5230-0286 | |
| Aspirating pipette tip | Any | ||
| BHK-21 Cells | ATCC | CCL-10 | |
| BION IFA Diluent | MBL BION | DIL-9993 | |
| Cell Culture water | Sigma-Aldrich | W3500 | EGM |
| Coplin Jars | Any | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | EGM |
| Fluorescent microscope with FITC filter | Any | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | Mountant |
| Gullsorb IgM inactivation reagent | Fisher Scientific | 23-043-158 | IgG Inactivation Reagent |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G-7513 | EGM |
| Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | M0643 | EGM |
| Mouse Neuroblastoma Cells | ATCC | CCL-131 | |
| Multi-well Teflon coating glass slides | Any | ||
| PBS | Any | pH 7.6 | |
| Penicillin | Sigma | P-3032 | EGM |
| Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate | Millipore Sigma | 5100, 5500 or 6500 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | EGM |
| Sodium Chloride crystals | Sigma-Aldrich | S5886 | Mountant |
| Sterile dropper | Any | ||
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S9137 | EGM |
| Trizma pre-set crystals pH 9.0 | Sigma-Aldrich | S9693 | Mountant |
| Tryptose Phosphate Broth | BD | 260300 | EGM |
| Vitamin mix | Sigma-Aldrich | M6895 | EGM |
References
- Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1. World Health Organization. , 232-245 (2018).
- Moore, S. M. Challenges of rabies serology: defining context of interpretation. Viruses. 13 (8), 1516 (2021).
- Zajac, M. D. Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera. Viruses. , 40-49 (2019).
- Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis. Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).
- Fooks, A. R., Jackson, A. C. . Rabies: scientific basis of the disease and its management. , (2020).
- Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).
- Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).
- Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. Immunological aspects of rabies: a literature review. Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).
- Moore, S. M., Hanlon, C. A. Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595 (2010).
