نافذة مستقرة للتصوير داخل الجسم للبنكرياس الفئران
Summary
نقدم بروتوكولا للزرع الجراحي لنافذة بصرية مستقرة للتصوير بدقة تحت الخلوية لبنكرياس الفئران ، مما يسمح بإجراء دراسات تسلسلية وطولية للبنكرياس السليم والمريض.
Abstract
علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية للبنكرياس معقدة. أمراض البنكرياس ، مثل التهاب البنكرياس وسرطان البنكرياس الغدي (PDAC) لها معدلات مراضة ووفيات عالية. التصوير داخل الجسم (IVI) هو تقنية قوية تمكن من التصوير عالي الدقة للأنسجة في كل من الحالات الصحية والمريضة ، مما يسمح بمراقبة ديناميكيات الخلية في الوقت الفعلي. يمثل IVI لبنكرياس الفئران تحديات كبيرة بسبب الطبيعة الحشوية العميقة والمتوافقة للعضو ، مما يجعله عرضة بشدة للتلف والتحف المتحركة.
الموصوفة هنا هي عملية زرع Stabilized Window للتصوير Intravital للفأر Pancreas (SWIP). يسمح SWIP ب IVI لبنكرياس الفئران في الحالات الصحية الطبيعية ، أثناء التحول من البنكرياس السليم إلى التهاب البنكرياس الحاد الناجم عن السيرولين ، وفي الحالات الخبيثة مثل أورام البنكرياس. بالاقتران مع الخلايا الموسومة وراثيا أو إعطاء الأصباغ الفلورية ، يتيح SWIP قياس ديناميكيات الخلية الواحدة وتحت الخلوية (بما في ذلك الخلية المفردة والهجرة الجماعية) بالإضافة إلى التصوير التسلسلي لنفس المنطقة ذات الاهتمام على مدار عدة أيام.
تعتبر القدرة على التقاط هجرة الخلايا السرطانية ذات أهمية خاصة لأن السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان في PDAC هو العبء النقيلي الهائل. يعد فهم الديناميات الفسيولوجية للورم الخبيث في PDAC حاجة حرجة لم تتم تلبيتها وحاسمة لتحسين تشخيص المريض. بشكل عام ، يوفر SWIP استقرارا محسنا للتصوير ويوسع تطبيق IVI في البنكرياس السليم وأمراض البنكرياس الخبيثة.
Introduction
من المحتمل أن تكون أمراض البنكرياس الحميدة والخبيثة مهددة للحياة ، مع وجود فجوات كبيرة في فهم الفيزيولوجيا المرضية الخاصة بها. التهاب البنكرياس – التهاب البنكرياس – هو السبب الرئيسي الثالث لدخول المستشفيات وإعادة الدخول إلى المستشفى المرتبط بأمراض الجهاز الهضمي في الولايات المتحدة ويرتبط بالمراضة الكبيرة والوفيات والعبء الاجتماعي والاقتصادي1. يحتل سرطان البنكرياس الغدي القنوي (PDAC) المرتبة الثالثة كسبب رئيسي للوفاة المرتبطة بالسرطان 2 ، ويمثل معظم الأورام الخبيثة في البنكرياس3 وينذر بمعدل بقاء ضعيف لمدة 5 سنوات يبلغ 11٪ فقط 2. السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان في PDAC هو العبء النقيلي الساحق. لسوء الحظ ، فإن معظم المرضى يعانون من مرض النقيلي. لذلك ، فإن فهم ديناميكيات ورم خبيث في PDAC هو حاجة ماسة لم تتم تلبيتها في مجال أبحاث السرطان.
الآليات التي يقوم عليها الالتهاب والشلال النقيلي للبنكرياس غير مفهومة بشكل جيد. أحد المساهمين الرئيسيين في هذه الفجوة في المعرفة هو عدم القدرة على مراقبة ديناميكيات خلايا البنكرياس في الجسم الحي. تعد المراقبة المباشرة لهذه الديناميات الخلوية بالكشف عن أهداف مهمة للاستفادة من تشخيص وعلاج المصابين بأمراض البنكرياس وتحسينها.
التصوير داخل الجسم (IVI) هو تقنية مجهرية تسمح للباحثين بتصور ودراسة العمليات البيولوجية في الحية في الوقت الفعلي. يسمح IVI بالتصور المباشر عالي الدقة لديناميكيات داخل الخلايا والبيئة الدقيقة في الجسم الحي وداخل البيئة الأصلية للعملية البيولوجية المعنية. لذلك ، يسمح IVI في الجسم الحي بمراقبة العمليات الصحية والمرضية.
توفر طرق التصوير المعاصرة لكامل الجسم مثل التصوير بالرنين المغناطيسي والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني والتصوير المقطعي المحوسب مناظر ممتازة للأعضاء بأكملها ويمكن أن تكشف عن الأمراض ، حتى قبل ظهور الأعراض السريرية4. ومع ذلك ، فهي غير قادرة على تحقيق حل خلية واحدة أو الكشف عن المراحل المبكرة من مرض التهاب البنكرياس أو الورم الخبيث.
استخدمت الأبحاث السابقة دقة IVI أحادية الخلية لمراقبة الأمراض الحميدة والخبيثة للجلد 5,6 ، والثدي7 ، والرئة8 ، والكبد9 ، والدماغ 10 ، وأورام البنكرياس 11 ، مما أدى إلى رؤى حول آليات تطور المرض 12. ومع ذلك ، فإن بنكرياس الفئران يشكل عقبات كبيرة أمام تحقيق دقة الخلية الواحدة باستخدام IVI ، ويرجع ذلك أساسا إلى موقعه الحشوي العميق والامتثال العالي. علاوة على ذلك ، فهو عضو متفرع وموزع بشكل منتشر داخل المساريق يتصل بالطحال والأمعاء الدقيقة والمعدة ، مما يجعل الوصول إليه صعبا. كما أن الأنسجة حساسة للغاية للحركة الناتجة عن التمعج والتنفس المجاورين. يعد تقليل حركة البنكرياس أمرا ضروريا للفحص المجهري أحادي الخلية ، حيث يمكن للقطع الأثرية الحركية حتى بضعة ميكرونات أن تطمس الصور وتشوهها ، مما يجعل تتبع ديناميكيات الخلايا الفرديةمستحيلا 13.
لإجراء IVI ، يجب زرع نافذة تصوير البطن (AIW) جراحيا 9,11. لزرع AIW جراحيا ، يتم خياطة إطار نافذة معدني في جدار البطن. بعد ذلك ، يتم توصيل العضو محل الاهتمام بالإطار باستخدام لاصق cyanoacrylate. في حين أن هذا يكفي لبعض الأعضاء الداخلية الصلبة (مثل الكبد والطحال والأورام الصلبة) ، فإن محاولات تصوير بنكرياس الفئران السليم تتعرض للخطر بسبب الاستقرار الجانبي والمحوري دون المستوى الأمثل بسبب نسيج الأنسجة المتوافق والبنية المعقدة14. لمعالجة هذا القيد ، طور Park et al.14 نافذة تصوير مصممة خصيصا للبنكرياس الصحي. تقلل نافذة تصوير البنكرياس (PIW) من تأثير حركة الأمعاء والتنفس من خلال دمج رف معدني أفقي داخل إطار النافذة ، أسفل غطاء الغطاء مباشرة ، مما يؤدي إلى استقرار الأنسجة والحفاظ على ملامستها لزجاج الغطاء. بينما يوفر PIW ثباتا جانبيا متزايدا ، وجدنا أن هذه النافذة لا تزال توضح الانجراف المحوري وتمنع بالإضافة إلى ذلك تصوير الأورام الصلبة الكبيرة بسبب الفجوة الضيقة بين الرف المعدني وغطاءالغطاء 15.
لمعالجة هذه القيود ، قمنا بتطوير Stabilized Window للتصوير Intravital للفأر Pancreas (SWIP) ، وهي نافذة تصوير قابلة للزرع قادرة على تحقيق تصوير مستقر طويل الأمد لكل من البنكرياس السليم والمريض (الشكل 1) 15. هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا للإجراء الجراحي المستخدم لزرع SWIP. على الرغم من أن الهدف الأساسي كان دراسة الآليات الديناميكية التي ينطوي عليها ورم خبيث ، إلا أنه يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لاستكشاف جوانب مختلفة من بيولوجيا البنكرياس وعلم الأمراض.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر بروتوكول SWIP الموصوف هنا طريقة محسنة لتثبيت أنسجة البنكرياس من خلال استخدام تقنية سلة الغرزة المتقاطعة. مكنت نوافذ تصوير البطن المبكرة (AIWs) من التصوير داخل الجسم (IVI) للأعضاء الداخلية للبطن ولكنها لم تحد بشكل كاف من حركة الأنسجة الرخوة مثل البنكرياس. استجابة لذلك ، طور Park et al. نافذة تصوي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
مؤسسة إيفلين ليبر الخيرية ، ومركز جروس ليبر للفوتونات الحيوية ، وبرنامج التصوير المتكامل لأبحاث السرطان ، وزمالة NIH T-32 (CA200561) ، ومنحة برنامج أبحاث سرطان البنكرياس التابع لوزارة الدفاع (PCARP) PA210223P1.
Materials
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | NA | Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Passivation reagent |
| 5 mm cover glass | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | Round Glass Coverslips |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | Passivation reagent |
| 28G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | Syringe for cell injection |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic |
| Bench Mount Heat Lamp | McMaster-Carr | 3349K51 | Heat lamp |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Covetrus North America | 059122 | Buprenorphine Analgesia |
| Castroviejo Curved Scissors | World Precision Instruments | WP2220 | Scissor for cutting tissue |
| C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J Mouse |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | Compressed air for drying tissue |
| Cyano acrylate – Gel Superglue | Staples | 234790-6 | Skin Glue |
| Cyano acrylate – Liquid Superglue | Staples | LOC1647358 | Coverslip Glue |
| DPBS 1x | Corning | 21-031-CV | DPBS for cerulein/cell injections |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Graefe Micro Dissecting Forceps |
| Imaging microscope | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Imaging software | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | Isoflurane Anesthesia |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Kim Wipes |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | Laboratory Tape |
| Mouse Dissecting Kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Surgical Instruments |
| Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific Corpo | MSTAT Sensor-MSE | Pulse Oximeter |
| Mouse Surgisuite | Kent Scientific | SURGI-M04 | Heated platform |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory Lotion |
| Oxygen | TechAir | OX TM | Oxygen |
| PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0 | VWR | 95056-872 | Silk Suture |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Life Technologies | 10010-023 | PBS |
| PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Heated Platform Controller |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | Cotton Swabs |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL | Denville Scientific Inc. | P1125 | 100 µL Pipet Tips |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | Vascular Label |
| Window-fixturing plate | NA | NA | Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8]. |
| Window Frame | NA | NA | The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8]. |
References
- Peery, A. F., et al. Burden and cost of gastrointestinal, liver, and pancreatic diseases in the United States: Update 2021. Gastroenterology. 162 (2), 621-644 (2022).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 73 (1), 17-48 (2023).
- Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338 (2017).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry A. 97 (5), 448-457 (2020).
- Peters, N. C., et al. In vivo imaging reveals an essential role for neutrophils in leishmaniasis transmitted by sand flies. Science. 321 (5891), 970-974 (2008).
- Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1147-1154 (2008).
- Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Park, K., You, J., Du, C., Pan, Y. Cranial window implantation on mouse cortex to study microvascular change induced by cocaine. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 5 (1), 97-107 (2015).
- Beerling, E., Oosterom, I., Voest, E., Lolkema, M., van Rheenen, J. Intravital characterization of tumor cell migration in pancreatic cancer. Intravital. 5 (3), e1261773 (2016).
- Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews: Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
- Entenberg, D., et al. time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
- Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
- Du, W., et al. SWIP-a stabilized window for intravital imaging of the murine pancreas. Open Biology Journal. 12 (6), 210273 (2022).
- DeBold, T. A. M., James, W. . How To Passivate Stainless Steel Parts. , (2003).
- Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
- Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), pdb prot5563 (2011).
- Moral, J. A., et al. ILC2s amplify PD-1 blockade by activating tissue-specific cancer immunity. Nature. 579 (7797), 130-135 (2020).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), dmm034793 (2018).
- Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042 (2016).
- Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 19, 19.7.1-19.7.19 (2013).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments. (116), 54603 (2016).
- Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments. (131), 55115 (2018).
- Gorelick, F. S., Lerch, M. M. Do animal models of acute pancreatitis reproduce human disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (2), 251-262 (2017).
- Dolai, S., et al. Depletion of the membrane-fusion regulator Munc18c attenuates caerulein hyperstimulation-induced pancreatitis. Journal of Biological Chemistry. 293 (7), 2510-2522 (2018).
- Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88 (5 Pt 1), 1192-1204 (1985).
- Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
- Shanja-Grabarz, X., Coste, A., Entenberg, D., Di Cristofano, A. Real-time, high-resolution imaging of tumor cells in genetically engineered and orthotopic models of thyroid cancer. Endocrine-Related Cancer. 27 (10), 529-539 (2020).
