简化活体成像方法，用于在倒置共聚焦显微镜上长期监测上皮组织动力学
Summary
该协议提供了一种新工具，可使用倒置共聚焦显微镜简化活体成像。
Abstract
了解正常和异常的 体内 细胞行为对于开发临床干预措施以阻止疾病的发生和进展是必要的。因此，优化成像方法至关重要，以促进原 位观察细胞动力学，其中组织结构和组成不受干扰。表皮是人体最外层的屏障，也是最普遍的人类癌症（即皮肤癌）的来源。皮肤组织的可及性为使用非侵入性活体显微镜监测完整动物的上皮和真皮细胞行为提供了独特的机会。然而，这种复杂的成像方法主要是使用正置多光子显微镜实现的，这对大多数研究人员来说是一个重要的进入壁垒。本研究提出了一种定制设计的 3D 打印显微镜载物台插件，适用于倒置共聚焦显微镜，简化了活转基因小鼠耳部皮肤的长期活体成像。我们相信，这项多功能发明可以定制以适应所选择的倒置显微镜品牌和型号，并适用于对其他器官系统进行成像，这将通过显着提高活体显微镜的可及性，为广大科学研究界证明是无价的。这种技术进步对于加强我们对正常和疾病背景下活细胞动力学的理解至关重要。
Introduction
活体显微镜是一种强大的工具，可以监测细胞在不受干扰的体内环境中的行为。这种独特的方法为复杂哺乳动物器官系统的内部运作提供了关键的见解，包括肺1、大脑2、肝脏3、乳腺4、肠5 和皮肤6。此外，这种方法还揭示了肿瘤发展过程中的细胞行为改变7、伤口愈合 8,9、炎症10 和其他不同的原位病理。在这项研究中，我们专注于增强活体显微镜对完整小鼠皮肤中实时上皮和基质动力学成像的可及性。由于哺乳动物皮肤具有显着的再生和致瘤能力，了解哺乳动物皮肤中的细胞行为具有很高的临床意义。
小鼠的活体成像主要使用正置多光子显微镜进行，因为它们能够在组织深度 >100 μm11,12 提供高分辨率成像。然而，这些仪器缺乏倒置共聚焦显微镜的主力多功能性和更普遍的可及性，后者更人性化、更具成本效益，能够对培养的细胞进行成像，在图像采集过程中不需要完全黑暗，并且通常更安全，以及其他显着优势13,14.在这项研究中，我们提出了一种新工具，通过将这种方法应用于倒置共聚焦显微镜，显着提高了活体成像的可及性。
在这里，我们展示了一种 3D 打印的定制载物台插入设计，该设计结合了几个关键功能，以促进在倒置共聚焦显微镜上对小鼠耳部皮肤进行稳定、长期的活体成像（图 1、图 2、图 3、图 4 和图 5）。这些特殊功能包括一个偏移物镜孔，允许成年小鼠的整个身体在成像过程中完全平放。这最大限度地减少了小鼠身体运动对成像的振动干扰，并且无需使用氯胺酮和甲苯噻嗪来抑制呼吸，这种做法通常与活体成像相结合6。此外，插入物上的角支架可正确定位异氟醚鼻锥以与鼠标正面对齐，金属耳夹将鼠标耳朵固定在定制的盖玻片上，可选的可拆卸闭环生物反馈加热板齐平放置在插入物内，以在长时间成像期间支持小鼠体温。定制的盖玻片盘为小鼠头部和耳朵平放提供了必要的平坦表面，它是在机械车间通过去除含有通用盖玻片的细胞培养皿的壁而产生的。将 40 倍硅油浸没透镜（1.25 数值孔径 [N.A.]，0.3 mm 工作距离）与盖玻片和定制载物台插件结合使用，可提供深入耳真皮> 50 μm 的高分辨率图像。
为了测试这种新的倒置显微镜载物台插入物的功能，我们在活的转基因K14-H2B-mCherry15成年小鼠的耳朵中捕获了跨越所有表皮上皮层的z-stacks（该小鼠系中的上皮细胞核含有红色荧光标记）（图6A-A‘）。我们还在活转基因 Pdgfra-rtTA16 的耳朵中捕获了 3 小时内跨越皮肤真皮内多个成纤维细胞层的 z 堆栈;pTRE-H 2 B – GFP17成年小鼠（该小鼠系中的成纤维细胞核在多西环素诱导后含有绿色荧光标记）（图6B-D‘）。我们的高分辨率数据显示，由于 x、y 和 z 平面没有漂移，因此具有一致的稳定性，从而证明了这种新型活体成像工具在倒置显微镜上使用的有效性。重要的是，这种3D打印载物台插件的尺寸可以调整，如补充文件1、补充文件2和补充文件3中所述，以适应任何倒置显微镜，并且物镜开口的位置可以移动到插件内的其他位置，以更好地适应感兴趣的特定组织和/或动物模型的成像。因此，这项发明可以使单个实验室或具有核心设施共聚焦访问能力的研究人员能够根据其独特的活体成像需求调整该工具，从而简化对各种体内细胞生物学的评估。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这项研究中，我们提出了一种新工具，该工具有助于在倒置共聚焦显微镜上对完整的小鼠皮肤上皮进行稳定、长期的活体成像。本发明由PLA制成，PLA是最常见和最便宜的3D打印材料;该插件的所有内部 3D 打印成本为 < 美元。两个独立的插入件（图 1、补充文件 1 和补充文件 2）可以使用固定螺钉轻松组装（参见 材料表）。值得注意的是?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢 Valentina Greco 的 K14-mCherry-H2B 小鼠。我们感谢埃默里大学物理系机械车间生产玻璃盖玻片盘。这项工作由美国退伍军人事务部 BLRD 服务向 LS 颁发的职业发展奖 #IK2 BX005370 资助，向 MJMR 颁发 NIH 奖 RF1-AG079269 和 R56-AG072473，以及向 MJMR 颁发的 I3 Emory SOM/GT 计算和数据分析奖。
Materials
| 3D Printer | Qudi Tech | i-Fast | 3D prints using PLA material |
| 40x 1.25NA silicone objective lens | Nikon | ||
| AxR Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | ||
| Cotton Tipped Swab | VWR | 76337-046 | Cream/ointment application |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice |
| Flathead Screwdriver (2.5 mm) | Affiix insert to microscope stage | ||
| Flathead Screws x 4 (#6-32) | Nikon | Screw insert into microscope stage | |
| Glass Bottom Culture Dish | chemglass Life Sciences | CLS-1811-002 | Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop |
| Heat Plate controller | Physitemp | TCAT-2LV | Animal Temperature Controller – Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring |
| Hex Wrench (1.5 mm) | For M3 setscrew adjustments | ||
| Hex Wrench (2.5 mm) | Adjust tension on metal ear clip | ||
| Intravital Imaging Insert | |||
| Isoflurane | Med-Vet International | HPA030782-100uL | Mouse anesthesia |
| Labeling Tape (or Scotch Tape) | VWR | 10127-458 | Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip |
| Metal fastener | used as ear clip | ||
| Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:034459 | Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression |
| Mouse: K14-H2BPAmCherry | Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University | Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry" | |
| Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J |
The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:005104 | Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline |
| Multipurpose Sealing Wrap | Glad | Enhance mouse warmth | |
| Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | Eye lubricant |
| Set screws x 3 (M3; 6 mm) | Thorlabs | SS3M6 | Attachment for heatplate module |
| Silicone Immersion Oil | Applied to 40x silicone objective | ||
| Small Animal Heating Plate | Physitemp | HP-4M | Provides heat to animal |
| Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | Mouse anesthesia |
| Vacuum Grease | Flinn Scientific | AP1095 | Seals coverslip disk to insert |
| Veet | hair removal | ||
| Water circulating heat pad | Stryker Medical | TP700 | for mouse revival post-imaging |
References
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