여기에서는 맥락총의 유전자 발현을 선택적으로 변경하면서 다른 뇌 영역에는 영향을 주지 않는 방법을 설명합니다.
맥락총(ChP)은 생리학적 및 병리학적 조건 모두에서 면역 세포가 중추신경계(CNS)로 침투하는 중요한 관문 역할을 합니다. 최근 연구에 따르면 ChP 활동을 조절하면 중추신경계 장애를 예방할 수 있습니다. 그러나 다른 뇌 영역에 영향을 주지 않고 ChP의 생물학적 기능을 연구하는 것은 섬세한 구조로 인해 어렵습니다. 이 연구는 아데노 관련 바이러스(AAV) 또는 TAT 서열(CRE-TAT)로 구성된 고리화 재조합 효소(Cre) 재조합 효소 단백질을 사용하여 ChP 조직에서 유전자 녹다운을 위한 새로운 방법을 제시합니다. 결과는 AAV 또는 CRE-TAT를 측심실에 주입한 후 형광이 ChP에만 집중되었음을 보여줍니다. 이 접근법을 사용하여 RNA 간섭(RNAi) 또는 X-overP1의 Cre/locus(Cre/LoxP) 시스템을 사용하여 ChP의 아데노신 A 2A 수용체(A2A R)를 성공적으로 녹다운하고 이 녹다운이 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)의 병리를 완화할 수 있음을 보여주었습니다. 이 기술은 중추신경계 장애에서 ChP의 역할에 대한 향후 연구에 중요한 영향을 미칠 수 있습니다.
맥락총(ChP)은 뇌척수액(CSF)과 뇌 유래 신경영양인자(BDNF)를 분비하여 뇌 기능적 항상성을 유지하는 데 도움이 되는 것으로 여겨지곤 합니다1,2. 지난 30년 동안 진행된 연구에서 ChP가 면역 세포가 중추신경계(CNS)로 침투하는 뚜렷한 경로를 나타낸다는 사실이 밝혀졌습니다.
단층 ChP 상피로 구성된 ChP의 단단한 연접(TJ)은 거대분자와 면역세포가 뇌로 들어가는 것을 막아 면역학적 항상성을 유지한다3. 그러나 특정 병리학적 조건에서 ChP 조직은 뇌척수액과 혈액의 위험 관련 분자 패턴(DAMP)을 감지하고 반응하여 비정상적인 면역 침윤 및 뇌 기능 장애를 유발합니다 4,5. 중요한 역할에도 불구하고 ChP의 작은 크기와 뇌의 독특한 위치로 인해 다른 뇌 영역에 영향을 미치지 않고 기능을 연구하기가 어렵습니다. 따라서 ChP에서 유전자 발현을 특이적으로 조작하는 것은 그 기능을 이해하는 데 이상적인 접근 방식입니다.
초기에, ChP에서 발현된 유전자에 특이적인 프로모터의 제어 하에 Cre를 발현하는 고리화 재조합 효소(Cre) 형질전환 계통은 플록싱된 후보 유전자 6,7,8과 육종하여 표적 유전자를 삭제하는데 일반적으로 사용되었다. 예를 들어, 전사인자 포크헤드 박스 J1(FoxJ1)은 태아기 마우스 뇌(prenatal mouse brain)의 ChP 상피(ChP epithelium)에서만 독점적으로 발현된다(7). 따라서, FoxJ1-Cre 라인은 종종 ChP 6,9에 위치한 유전자를 삭제하는데 사용되었다. 그러나 이 전략의 성공은 프로모터의 특수성에 크게 의존합니다. FoxJ1은 뇌와 말초계의 다른 부분에 있는 섬모 상피 세포에도 존재하기 때문에 FoxJ1 발현 패턴이 충분히 뚜렷하지 않다는 것이 점차 발견되었다7. 이러한 한계를 극복하기 위해, Cre 재조합효소의 뇌뇌내 (ICV) 주사를 수행하여 플록스된 형질전환 라인의 심실로 재조합효소를 전달하였다. 이 전략은 ChP 조직10,11에서만 tdTomato 형광의 존재에 의해 입증 된 바와 같이 높은 특이성을 보여주었습니다. 그러나, 이 방법은 여전히 플록스된 형질전환 마우스 라인의 가용성에 의해 제한된다. 이 문제를 해결하기 위해 연구자들은 아데노 관련 바이러스(AAV)의 ICV 주입을 사용하여 ChP 특이적 녹다운 또는 표적 유전자12,13의 과발현을 달성했습니다. ChP 감염에 대한 다양한 AAV 혈청형을 종합적으로 평가한 결과, AAV2/5 및 AAV2/8은 ChP에서 강력한 감염 능력을 나타내면서 다른 뇌 영역은 감염시키지 않는 것으로 나타났습니다. 그러나 AAV2/8은 뇌실 주위의 뇌실막을 감염시키는 것으로 밝혀진 반면, AAV2/5 그룹은 감염을 나타내지 않았다14. 이 방법은 플록스드 형질전환 동물을 획득하는 한계를 극복할 수 있는 장점이 있다.
이 글에서는 아데노신 A 2A 수용체(A 2A R)의 shRNA를 운반하는 AAV2/5의 ICV와 A2A R의 ChP 특이적 knockdown을 달성하기 위해 TAT서열(CRE-TAT) 재조합효소로 구성된 Cre 재조합효소 단백질의 두 가지 방법을 사용하여 ChP에서 유전자 knockdown을 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다. 연구 결과에 따르면 ChP에서 A2AR을 녹다운하면 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 완화할 수 있습니다. 이 상세한 프로토콜은 ChP 기능 연구 및 ChP 유전자의 특정 knockdown에 유용한 지침을 제공합니다.
이 연구는 ChP 유전자의 표적 녹다운에 대한 두 가지 뚜렷한 접근 방식을 제시했습니다. 첫 번째 접근법은 Cre 재조합 효소를 함유한 CRE-TAT를 A2AR 플록스/플록스 마우스에 ICV로 주입하는 것이었습니다. 두 번째 접근법은 A2AR의 shRNA를 운반하는 AAV2/5의 ICV 주입을 수반했습니다. 이 두 가지 전략을 활용함으로써 ChP 내에서 A 2A R의 선택적 녹다운을 달성하고 EAE 병리학에 대한 ChP?…
The authors have nothing to disclose.
우리는 이 작업에 대한 중국 국립 자연 과학 재단(보조금 번호 31800903, W. Zheng에게 수여)과 Wenzhou Science and Technology Project(No. Y2020426, Y. Y. Weng에게 수여)의 지원에 감사드립니다.
A2ARflox/flox mice | State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University | ||
AAV2/5-A2AR-ShRNA virus | Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
antifade mounting medium | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
borosilicate glass capillary | Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd | B100-50-10 | |
brain stereotaxic apparatus | RWD, Shenzhen | 69100 | |
C57BL/6 mice | Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
CRE-TAT recombinase | Millipore | SCR508 | |
DAPI | Absin | B25A031 | |
frozen slicing machine | Leica | CM1950 | |
H37Ra | Becton Dickinson and company | 231141 | |
Hamilton syringe | Hamilton, American | P/N: 86259 | |
Incomplete Freunds adjuvant | Sigma | F5506 | |
Laser confocal microscope | Zeiss | LSM900 | |
MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
OCT glue | Epredia | 6502p | |
paraformaldehyde | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
pentobarbital sodium | Boyun Biotech | PC13003 | |
Pipette gun | Eppendorf | N45014F | |
PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit | Takara | 6110A | |
Real- Time PCR System | BioRad | CFX96 | |
Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice | Jackson Laboratory | ||
sucrose | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
super high speed homogenizer | IKA | 3737025 | |
Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
xylene solution | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 1330-20-7 |