Summary

בידוד וטיהור שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות מצואת אדם באמצעות צנטריפוגת שיפוע צפיפות

Published: September 01, 2023
doi:

Summary

מחקר זה מתאר שיטה לבידוד וטיהור שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות (BEVs) המועשרות מצואת אדם באמצעות צנטריפוגת שיפוע צפיפות (DGC), מזהה את המאפיינים הפיזיים של BEV ממורפולוגיה, גודל חלקיקים וריכוז, ודן ביישומים האפשריים של גישת DGC במחקר קליני ומדעי.

Abstract

שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות (BEVs) הן ננו-שלפוחיות שמקורן בחיידקים הממלאים תפקיד פעיל בתקשורת חיידקים-חיידקים וחיידקים-מארחים, ומעבירים מולקולות ביו-אקטיביות כגון חלבונים, שומנים וחומצות גרעין העוברות בתורשה מחיידקי האם. ל-BEV שמקורו במיקרוביוטה של המעי יש השפעות בתוך מערכת העיכול והוא יכול להגיע לאיברים מרוחקים, וכתוצאה מכך יש לו השלכות משמעותיות על הפיזיולוגיה והפתולוגיה. מחקרים תיאורטיים שחוקרים את הסוגים, הכמויות והתפקידים של כ”ד שמקורם בצואה אנושית חיוניים להבנת ההפרשה והתפקוד של כ”ד מהמיקרוביוטה של המעי. חקירות אלה מחייבות גם שיפור באסטרטגיה הנוכחית לבידוד וטיהור כלי רכב חשמליים.

מחקר זה ייעל את תהליך הבידוד והטיהור של כלי רכב חשמליים על ידי הקמת שני מצבי צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות (DGC): מלמעלה למטה ומלמטה למעלה. ההתפלגות המועשרת של כלי רכב חשמליים נקבעה בשברים 6 עד 8 (F6-F8). יעילות הגישה הוערכה בהתבסס על מורפולוגיה של חלקיקים, גודל, ריכוז ותכולת חלבונים. שיעורי התאוששות החלקיקים והחלבונים חושבו, ונוכחותם של סמנים ספציפיים נותחה כדי להשוות את ההתאוששות והטוהר של שני מצבי DGC. התוצאות הצביעו על כך שמצב הצנטריפוגה מלמעלה למטה היה בעל רמות זיהום נמוכות יותר והשיג שיעור התאוששות וטוהר דומים לזה של מצב מלמטה למעלה. זמן צנטריפוגה של 7 שעות הספיק כדי להשיג ריכוז BEV צואתי של 108/מ”ג.

מלבד צואה, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על סוגים אחרים נוזלי גוף עם שינוי נכון על פי ההבדלים ברכיבים צמיגות. לסיכום, פרוטוקול מפורט ואמין זה יקל על בידוד וטיהור סטנדרטיים של כ”ד ובכך יניח בסיס לניתוח מולטי-אומיקס וניסויים פונקציונליים הבאים.

Introduction

המעי מוכר באופן נרחב כאיבר המאחסן את קהילות החיידקים הנפוצות ביותר בגוף האדם, כאשר מעל 90% מהחיידקים מעורבים בהתיישבות ובהכפלה 1,2. עדויות נרחבות הוכיחו כי מיקרוביוטת המעיים מווסתת את המיקרו-סביבה של המעי ובו זמנית מתקשרת עם תפקוד לקוי באיברים מרוחקים, בעיקר באמצעות מחסום מעיים לקוי 3,4. עדויות מצטברות מצביעות על מתאם בין חוסר איזון של מיקרוביוטת המעי לבין התקדמות מחלות מעי דלקתיות (IBD)5,6, כמו גם הפרעות קוגניטיביות דרך ציר מעי-מוח 5,6,7,8. שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות (BEVs) המיוצרות על ידי חיידקים ממלאות תפקידים משמעותיים בתהליכים פתולוגיים אלה.

BEV הם חלקיקים ננומטריים העוטפים נגזרות חיידקיות, בקטרים הנעים בין 20 ל-400 ננומטר. הם הוכחו כמסייעים לאינטראקציות בין חיידקים לבין האורגניזמים המארחים שלהם 9,10. למרות היותם בלתי נראים, חלקיקים אלה זכו לתשומת לב הולכת וגוברת מצד חוקרים בשל היישומים הרחבים הפוטנציאליים שלהם כסמנים ביולוגיים אבחנתיים, מטרות טיפוליות וכלי משלוח תרופות11. צואת אדם, המשמשת לעתים קרובות כדגימות ביולוגיות לחקר BEVs, שמקורה בעיקר בחיידקי מעיים, מכילה תערובת מורכבת של מים, חיידקים, שומנים, חלבונים, שאריות מזון לא מעוכלות ותאי אפיתל מתקלפים, בין היתר. הרכב הצואה המורכב מציב אתגרים לבידוד ולטוהר של כלי רכב חשמליים, ובכך מעכב ניתוח מקיף, אובייקטיבי ומציאותי של כלי רכב חשמליים. לפיכך, אסטרטגיות יעילות למזעור הפרעות מרכיבים מזהמים ושיפור התפוקה של BEV התגלו כנושאים קריטיים המצדיקים תשומת לב מיידית.

אסטרטגיות בידוד קיימות מסתמכות במידה רבה על טכניקות כגון צנטריפוגה במהירות גבוהה במיוחד (UC), צנטריפוגה שיפוע צפיפות (DGC) וכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC)12,13,14,15,16,17. נכון לעכשיו, DGC היא אחת השיטות המיושמות ביותר בתחום הפרדת BEV, הכוללת שני מצבי שיקוע צפים, “מלמעלה למטה” ו “מלמטה למעלה”, אשר נקבעים על ידי מיקום הטעינה הראשונית של המדגם. מתודולוגיות אלה מבדילות בועיות חוץ-תאיות (EVs) מרכיבים אחרים בהתבסס על פערי גודל וצפיפות, ומניבות שיעורי טוהר והתאוששות משתנים. מחקרים קודמים הצביעו על כך שאסטרטגיות של גישה אחת אינן מספיקות להפרדה מספקת של כלי רכב חשמליים מחלבונים מסיסים בדגימות נוזלי גוף, כגון ליפופרוטאין בדם18 וחלבון Tamm-Horsfall בשתן19. בנוסף, התפלגות הגודל של שלפוחיות חוץ-תאיות אאוקריוטיות (EEVs) חופפת לעתים קרובות לזו של BEVs, ולכן מחייבת שיפורים מתודולוגיים נוספים כדי לייעל את תפוקת ה-BEV. כתוצאה מכך, קידום המחקר של BEV תלוי בפיתוח מתודולוגיות הפרדה וטיהור יעילות. יש לציין כי Tulkens et al 15 השתמשו באסטרטגיה ביופיזיקלית אורתוגונלית כדי להפריד בין כלי רכב חשמליים צואתיים לבין EEVs, שבה זמן הצנטריפוגה של מצב DGC מלמטה למעלה היה עד18 שעות. לעומת זאת, מחקר זה צמצם אותו ל-7 שעות, ובכך חסך מאוד את זמן האולטרה-צנטריפוגה ההדרגתית ופישט את התהליך.

במחקר הנוכחי, בודדנו וטיהרנו כלי רכב חשמליים צואתיים באמצעות שני מצבי DGC בתנאי חיץ אופטימליים, לאחר שהעשרת כלי רכב חשמליים במגוון מהירויות צנטריפוגה דיפרנציאליות, ממהירות נמוכה למהירות גבוהה במיוחד. הערכות המבוססות על מורפולוגיה, גודל חלקיקים וריכוז הצביעו על ביצועים ראויים לשבח בשיטה משופרת זו. מחקר זה יכול לשמש בסיס למחקר עתידי, להרחיב את יישומו לתחום רחב יותר, ולהציע תובנות לגבי ההטרוגניות של כלי רכב חשמליים בגוף האדם. זה גם תורם לסטנדרטיזציה של הפרדת BEV וטכניקות ניתוח.

Protocol

ועדת האתיקה של בית החולים נאן-פאנג, האוניברסיטה הרפואית הדרומית, אישרה מחקר זה, שנערך בהסכמה מדעת של המשתתפים. כל השיטות הננקטות במסמך זה עומדות בהנחיות ההפעלה הסטנדרטיות המסופקות על ידי תקני המיקרוביום האנושי הבינלאומיים (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). כל נהלי הטיפול בנוזלים הבאים חויבו להתבצ…

Representative Results

קביעת ההתפלגות של שברים מועשרים ב-BEVכדי לקבוע את התפלגות השברים המועשרים בשלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות (BEVs), הוקמה בקרה ריקה למדידת ערכי הספיגה ב-OD 340 ננומטר, והצפיפות של כל שבר חושבה על סמך המדידות והנחיות היודיקסנול (שלב 8.1). טבלה 2 מציגה את תוצאות הצפיפות, ומדגימה כי שבר?…

Discussion

שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות (BEVs) הן ננו-חלקיקים דו-שכבתיים ליפידים המופרשים על-ידי חיידקים, נושאים שפע של חלבונים, שומנים, חומצות גרעין ומולקולות ביו-אקטיביות אחרות, התורמות לתיווך ההשפעות התפקודיות של חיידקים20. BEV שמקורו במעיים אומת כמעורב בהתפתחות מחלות, כגון מחלות מעי דלקת?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע לחוקרים צעירים מצטיינים (82025024); פרויקט המפתח של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82230080); תוכנית המו”פ הלאומית של סין (2021YFA1300604); הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81871735, 82272438 ו-82002245); קרן גואנגדונג למדעי הטבע לחוקרים צעירים מצטיינים (2023B1515020058); הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (2021A1515011639); תוכנית פיתוח המחקר הבסיסית של הקרן למדעי הטבע של פרובינציית שאנדונג בסין (ZR2020ZD11); הקרן לפוסט-דוקטורט במדע (2022M720059); תוכנית פיתוח הצעירים המצטיינים של בית החולים נאן-פאנג, האוניברסיטה הרפואית הדרומית (2022J001).

Materials

1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) ACMEC AP1126 Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3
1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) Sigma-Aldrich M7027 Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6
1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) Polysciences 21447-25 Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5
1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette KIRGEN KG1313, KG1212, KG1011 Transfer the solution
5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) Fdbio science FD0030 Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6
5 × loading buffer Fdbio science FD006 Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1
75 % (v/v) alcohol LIRCON LIRCON-500 mL Surface disinfection
96-well plate Rar A8096 Measure the absorbance values 
Anti-Calnexin antibody Abcam ab92573 Western blotting (Primary Antibody)
Anti-CD63 antibody Abcam ab134045 Western blotting (Primary Antibody)
Anti-CD9 antibody Abcam ab236630 Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Flagellin antibody Sino Biological 40067-MM06 Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Integrin beta 1 antibody Abcam ab30394 Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LPS antibody Thermo Fisher MA1-83152 Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LTA antibody Thermo Fisher  MA1-7402 Western blotting (Primary Antibody)
Anti-OmpA antibody CUSABIO CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Syntenin antibody Abcam ab133267 Western blotting (Primary Antibody)
Anti-TSG101 antibody Abcam ab125011 Western blotting (Primary Antibody)
Autoclave ZEALWAY GR110DP Sterilization for supplies and mediums used in the experiment
Balance Mettler Toledo AL104 Balance the tube sample-loaded with PBS
Bicinchoninic acid assay  Fdbio science FD2001 Measure protein content of BEVs at Step 8.2
BioRender BioRender https://app.biorender.com Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1
Biosafety cabinet Haier HR1200- II B2 Peform the procedures about feces sample handling
Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 Eppendorf 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 Preprocess for BEVs (Step 3)
Chemiluminescence Apparatus BIO-OI OI600SE-MF Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12
Cytation 5 BioTek F01 Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values 
Dil-labled low density lipoprotein ACMEC AC12038 Definition of distribution of interfering components 
Electrophoresis equipment Bio-rad 1658033 Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5
Enhanced Chemiluminescence kit HRP  Fdbio science FD8020 Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12
Escherichia coli  American Type Culture Collection ATCC8739 Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4).    
Falcon tubes 50 mL KIRGEN KG2811 Preprocess for BEVs (Step 3)
Feto Protein Staining Buffer Absci ab.001.50 Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4
Filter paper Biosharp BS-TFP-070B Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution)
Formvar/Carbon supported copper grids  Sigma-Aldrich TEM-FCF200CU50 Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3
HEPES powder Meilunbio MB6078 Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Fdbio science FDM007 Western blotting (Secondary Antibody)
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Fdbio science FDR007 Western blotting (Secondary Antibody)
Incubator shaker Qiangwen DHZ-L Cultivate Escherichia coli 
Kimwipes™ Delicate Task Wipes Kimtech Science 34155 Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15
LB broth Hopebio HB0128 Cultivate Escherichia coli 
Low temperature freezer (-80 °C) Haier DW-86L338J Store the samples
Methanol Alalddin M116118 Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5
Micro tubes 1.5 mL KIRGEN KG2211 Recover fractions after density gradient centrifugation
Micro tubes 2 mL KIRGEN KG2911 Recover fractions after density gradient centrifugation
Micro tubes 5 mL BBI F610888-0001 Recover fractions after density gradient centrifugation
Microplate reader  Thermo Fisher  Multiskan MK3 Measure protein content of BEVs at Step 8.2
Millipore filter 0.22 μm Merck millipore SLGP033RB Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES
NaCl GHTECH 1.01307.040 Density gradient centrifugation solution
NaOH GHTECH 1.01394.068 Density gradient centrifugation solution (pH adjustment)
Optima™ XPN-100 Beckman Coulter A94469 Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
OptiPrep™ Serumwerk Bernburg AG 1893 Density gradient centrifugation stock solution
Orbital Shaker Youning CS-100 Dissolve feces at Step 2
Phosphate buffered saline Procell PB180327 Dissolve feces at Step 2
Pipettor Eppendorf 3120000267, 3120000259 Transfer the solution
Plastic pasteur pipette ABCbio ABC217003-4 Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes Millipore ISEQ00010, IPVH00010 Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5
Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells ACE F15420Gel Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3
Primary antibody diluent Fdbio science FD0040 Used in western blotting at Step 8.5.8
Protein ladder Fdbio science FD0672 Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5
Rapid protein blotting solution UBIO UW0500 Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5
Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter 369650 Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
Syringe 20 mL, 50 mL  Jetway ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing
TBS powder Fdbio science FD1021 Used in western blotting at Step 8.5
Transmission electron microscope (TEM) Hitachi  H-7650 Morphological observation for BEVs at Step 8.3
Tween-20 Fdbio science FD0020 Used in western blotting at Step 8.5
Ultracentrifuge tube Beckman 326823, 355642 Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
Ultra-clean bench AIRTECH SW-CJ-2FD Peform the procedures about liquid handling
Water bath Bluepard CU600 Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5
ZetaView Particle Metrix S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4

References

  1. Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
  2. Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P. The human gut microbiome in health: establishment and resilience of microbiota over a lifetime. Environmental Microbiology. 18 (7), 2103-2116 (2016).
  3. de Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
  4. Zhou, P., Yang, D., Sun, D., Zhou, Y. Gut microbiome: New biomarkers in early screening of colorectal cancer. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 36 (5), 24359 (2022).
  5. Paik, D., et al. Human gut bacteria produce Τ(Η)17-modulating bile acid metabolites. Nature. 603 (7903), 907-912 (2022).
  6. Parada Venegas, D., et al. Short chain fatty acids (SCFAs)-mediated gut epithelial and immune regulation and its relevance for inflammatory bowel diseases. Frontiers in Immunology. 10, 277 (2019).
  7. Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The Gut microbiota and Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
  8. Morais, L. H., Schreiber, H. L. t., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  9. Kim, J. H., Lee, J., Park, J., Gho, Y. S. Gram-negative and Gram-positive bacterial extracellular vesicles. Seminars in Cell and Developmental Biology. 40, 97-104 (2015).
  10. Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
  11. Xie, J., Li, Q., Haesebrouck, F., Van Hoecke, L., Vandenbroucke, R. E. The tremendous biomedical potential of bacterial extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 40 (10), 1173-1194 (2022).
  12. Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  13. Northrop-Albrecht, E. J., Taylor, W. R., Huang, B. Q., Kisiel, J. B., Lucien, F. Assessment of extracellular vesicle isolation methods from human stool supernatant. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (4), 12208 (2022).
  14. Park, Y. E., et al. Microbial changes in stool, saliva, serum, and urine before and after anti-TNF-α therapy in patients with inflammatory bowel diseases. Scientific Reports. 12 (1), 6359 (2022).
  15. Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization. Nature Protocols. 15 (1), 40-67 (2020).
  16. Tulkens, J., et al. Increased levels of systemic LPS-positive bacterial extracellular vesicles in patients with intestinal barrier dysfunction. Gut. 69 (1), 191-193 (2020).
  17. Kang, C. S., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota, especially Akkermansia muciniphila, protect the progression of dextran sulfate sodium-induced colitis. PloS one. 8 (10), 76520 (2013).
  18. Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
  19. Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12184 (2022).
  20. Liang, X., et al. Gut bacterial extracellular vesicles: important players in regulating intestinal microenvironment. Gut Microbes. 14 (1), 2134689 (2022).
  21. Alberti, G., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota in inflammatory bowel disease and colorectal cancer. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 165 (3), 233-240 (2021).
  22. Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet. Journal of Physiology and Biochemistry. 78 (2), 485-499 (2022).
  23. Lajqi, T., et al. Gut microbiota-derived small extracellular vesicles endorse memory-like inflammatory responses in murine neutrophils. Biomedicines. 10 (2), 442 (2022).
  24. Lee, K. E., et al. The extracellular vesicle of gut microbial Paenalcaligenes hominis is a risk factor for vagus nerve-mediated cognitive impairment. Microbiome. 8 (1), 107 (2020).
  25. Villard, A., Boursier, J., Andriantsitohaina, R. Bacterial and eukaryotic extracellular vesicles and nonalcoholic fatty liver disease: new players in the gut-liver axis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (4), G485-G495 (2021).
  26. Wei, S., et al. Outer membrane vesicles enhance tau phosphorylation and contribute to cognitive impairment. Journal of Cellular Physiology. 235 (5), 4843-4855 (2020).
  27. Bitto, N. J., Kaparakis-Liaskos, M. Methods of bacterial membrane vesicle production, purification, quantification, and examination of their immunogenic functions. Methods in Molecular Biology. 2523, 43-61 (2022).
  28. Stentz, R., Miquel-Clopés, A., Carding, S. R. Production, isolation, and characterization of bioengineered bacterial extracellular membrane vesicles derived from Bacteroides thetaiotaomicron and their use in vaccine development. Methods in Molecular Biology. 2414, 171-190 (2022).
  29. Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nature Protocols. 18 (5), 1462-1487 (2023).
  30. Iwai, K., Minamisawa, T., Suga, K., Yajima, Y., Shiba, K. Isolation of human salivary extracellular vesicles by iodixanol density gradient ultracentrifugation and their characterizations. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 30829 (2016).
  31. Vandeputte, D., et al. Stool consistency is strongly associated with gut microbiota richness and composition, enterotypes and bacterial growth rates. Gut. 65 (1), 57-62 (2016).
  32. Wen, M., et al. Bacterial extracellular vesicles: A position paper by the Microbial Vesicles Task Force of the Chinese Society of Extracellular Vesicles. Interdisciplinary Medicine. 1, 12046 (2023).

Play Video

Cite This Article
Xue, Y., Huang, X., Ou, Z., Wu, Y., Li, Q., Huang, X., Wen, M., Yang, Y., Situ, B., Zheng, L. Isolation and Purification of Bacterial Extracellular Vesicles from Human Feces Using Density Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (199), e65574, doi:10.3791/65574 (2023).

View Video