Summary
El diseño experimental presentado aquí proporciona un modelo reproductivo útil para los estudios de células T CD8+ específicas de antígeno durante la metástasis de ganglios linfáticos (LN), que excluye la perturbación de las células T CD8+ espectadoras.
Abstract
Las células T CD8+ específicas del antígeno tumoral de los ganglios linfáticos drenantes adquieren una importancia acumulativa en el montaje de la respuesta inmunitaria antitumoral durante la tumorigénesis. Sin embargo, en muchos casos, las células cancerosas forman loci metastásicos en los ganglios linfáticos antes de seguir haciendo metástasis en órganos distantes. No se sabe hasta qué punto las respuestas locales y sistemáticas de las células T CD8+ se vieron influidas por la metástasis de la LN. Con este fin, establecimos un modelo murino de metástasis LN combinado con una línea celular de melanoma B16F10-GP que expresa el neoantígeno sustituto derivado del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), la glicoproteína (GP) y los ratones transgénicos P14 que albergan receptores de células T (TCR) específicos del péptido derivado de GP GP33-41 presentado por la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I H-2Db. Este protocolo permite el estudio de las respuestas de los linfocitos T CD8+ específicos de antígeno durante la metástasis de LN. En este protocolo, a los ratones C57BL/6J se les implantaron por vía subcutánea células B16F10-GP, seguidas de una transferencia adoptiva con células P14 vírgenes. Cuando el tumor subcutáneo creció hasta aproximadamente 5 mm de diámetro, se extirpó el tumor primario y se inyectaron células B16F10-GP directamente en el ganglio linfático que drena el tumor (TdLN). A continuación, se monitorizó la dinámica de los linfocitos T CD8+ durante el proceso de metástasis de LN. En conjunto, este modelo ha proporcionado un enfoque para investigar con precisión las respuestas inmunitarias de las células T CD8+ específicas de antígeno durante la metástasis de LN.
Introduction
La inmunoterapia contra el cáncer, especialmente el bloqueo de puntos de control inmunitario (BCI), ha revolucionado la terapia contra el cáncer1. El BCI bloquea los inmunorreceptores coinhibidores (como PD-1, Tim-3, LAG-3 y TIGIT), que se expresan en gran medida en los linfocitos T CD8+ agotados en el microambiente tumoral (TME), lo que conduce a la revitalización de los linfocitos T CD8+ agotados2. Teniendo en cuenta la heterogeneidad de los linfocitos T CD8+ agotados, la evidencia acumulada reveló que los linfocitos T CD8+ específicos del tumor derivados de la periferia, incluido el ganglio linfático de drenaje (dLN), pero no en el TME, median la eficacia de la BCI 3,4,5,6,7,8. Recientemente, se confirmó que las células T CD8+ de memoria específicas para tumores TCF-1+TOX derivadas de TdLN (TdLN-T TSM) son las que responden genuinamente a la ICB, que incorporan varias propiedades funcionales de las células T de memoria convencionales y podrían expandirse y diferenciarse aún más en células agotadas de la progenie tras el tratamiento con ICB9. En conjunto, estos hallazgos corroboraron la importancia de la LN en el aumento de la inmunidad antitumoral.
Los ganglios linfáticos funcionan como un lugar crítico para facilitar el cebado y la activación de las células T CD8+ específicas del tumor al proporcionar una base estructural y señales biológicas10. Varios tipos de células cancerosas siembran con frecuencia el ganglio linfático centinela (GLC, el primer LN que drena un tumor primario) antes de la diseminación sistemática11. La presencia de metástasis en el GLC se relaciona con un pronóstico precario en el cáncer humano y los modelos preclínicos mostraron que las células tumorales en la NTdLN podrían diseminarse a órganos distantes a través de los vasos linfáticos y los vasos sanguíneos del ganglio 12,13,14,15. La biopsia de GLC ahora representa un procedimiento estándar para guiar las decisiones de tratamiento posteriores en muchos tipos de tumores sólidos, lo que podría evitar la resección innecesaria de LNno comprometida 16,17. Incluso para la LN afectada, sigue siendo controvertido si es necesaria la resección quirúrgica y cuándo, ya que varios estudios han demostrado que la extirpación de la LN regional no mostró una mejora de la supervivencia global en comparación con aquellos que recibieron radioterapia o terapia sistémica sin resección de la LN regional18,19. Una interpretación es que la LN metastásica (mLN) con enfermedad microscópica puede conservar cierta capacidad para educar a las células inmunitarias y proporcionar algunos beneficios terapéuticos. Por lo tanto, es de vital importancia dilucidar cómo la metástasis de LN afecta la respuesta inmune antitumoral, especialmente las propiedades y funciones de TdLN-TTSM.
Hasta ahora, tanto los datos preclínicos como los clínicos han revelado algunas alteraciones estructurales y celulares en mLN20. Sin embargo, no se han delineado los cambios dinámicos de las células T CD8+ específicas del tumor durante la metástasis de la LN. Por lo tanto, es necesario desarrollar un modelo convincente de metástasis de LN para futuras investigaciones. De hecho, varios estudios han reportado modelos de mLN en ratones a través de diferentes vías 14,21,22. Por ejemplo, la metástasis espontánea en las LN axilares se llevó a cabo mediante la implantación de células de cáncer de mama 4T1 en la almohadilla de grasa mamaria22. En otro estudio, Reticker-Flynn et al. generaron líneas celulares de melanoma con alta incidencia de diseminación desde el tumor primario subcutáneo a las LN mediante la inoculación seriada de células tumorales cultivadas a partir de tejidos mLN disociados (nueve rondas)14. Otro modelo comúnmente utilizado se preparó mediante la inyección de células tumorales en la almohadilla del pie y los loci metastásicos se formarían en LN22 poplítea. En particular, es difícil evaluar los puntos temporales precisos de intervención porque la metástasis de LN en estos modelos no siempre es fiel.
En el presente estudio, se estableció un modelo murino de LN metastásico a través de la inyección intraganglionar de células B16F10-GP23,24, generadas por la inserción mediada por CRISPR/Cas9 de la secuencia génica de la glicoproteína (GP) del virus LCMV en el genoma de la línea celular B16F109. A continuación, estos ratones fueron transferidos con células P14 que albergan receptores de células T transgénicas (TCR) que reconocen específicamente el epítopo H-2Db GP33-41 25,26 y se pudo investigar la dinámica sistémica y local de las células T CD8+ específicas de antígeno durante la metástasis de LN. Nuestro diseño experimental proporciona un modelo útil para el estudio de las respuestas inmunes, especialmente de las células T CD8+ específicas de antígeno durante la metástasis de LN, lo que excluye la perturbación de las células T CD8+ espectadoras. Estos resultados afectarían a las opciones de tratamiento clínico de si se debe eliminar o retener la mLN y arrojarían nueva luz sobre la manipulación de la mLN para lograr los máximos beneficios terapéuticos.
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Protocol
Los ratones C57BL/6J (referidos a ratones B6) y los ratones transgénicos P14 naïve 9,27 utilizados tenían entre 6 y 10 semanas de edad y pesaban entre 18 y 22 g. Tanto el sexo masculino como el femenino se incluyeron sin aleatorización ni cegamiento. Todos los estudios en animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Agrícola de Qingdao.
1. Preparación del medio y reactivos
- Prepare el medio de cultivo de células de melanoma B16F10-GP, denominado D10 (medio DMEM completo) agregando DMEM, suero fetal bovino (FBS) al 10 %, penicilina/estreptomicina al 1 %, L-glutamina al 1 % con 100 U/ml de puromicina adicional. Mantenga un D10 estéril y guárdelo hasta 2 semanas a 2-4 °C.
- Prepare el medio R2 (para la terminación de la lisis de glóbulos rojos) agregando RPMI-1640 con 2% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina y L-glutamina al 1%.
- Prepare el tampón de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) agregando 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 2% de FBS y 0,01% de azida sódica. La adición de azida de sodio puede prolongar el tiempo de almacenamiento del tampón FACS, que se puede almacenar durante meses a 2-4 ° C.
- Prepare el tampón de lisis de glóbulos rojos (RBL) agregando 155 mM de NH4Cl, 10 mM de KHCO3 y 0,1 mM de ácido etilendiaminérgico tetraacético (EDTA) en agua doblemente destilada y ajuste su pH a 7,3. Almacene el tampón RBL a temperatura ambiente (RT) y se mantendrá estable hasta por 3 meses.
- Prepare el anestésico, 2,2,2-tribromoetanol, como se describe a continuación.
- Pesar la cantidad adecuada de cristal de 2,2,2-tribromoetanol en un tubo cónico estéril de 50 ml envuelto con papel de aluminio. Agregue la cantidad adecuada de 2-metil-2-butanol en el cristal para preparar la solución madre con una concentración de 500 mg/ml.
- Agite para mezclar y calentar el tubo en un baño de agua a 37 °C hasta que el cristal se disuelva. Asegúrese de que todos los cristales estén disueltos.
- Mezcle bien la solución. Filtrar la solución madre con un filtro de 0,22 μm en un recipiente estéril. Almacenar la solución madre congelada, protegida de la luz, a -20 °C o diluirla con PBS en una solución de trabajo a una concentración de 12,5 mg/ml y almacenarla a 4 °C.
NOTA: Es mejor usar la concentración prescrita ya que las concentraciones más altas del líquido son irritantes.
2. Preparación de la suspensión de celdas B16F10-GP
- Descongelar y cultivar un vial de 1 x 106 células B16F10-GP con 5 mL de D10 en una incubadora de cultivo celular a 37 °C y 5% de CO2. Células de subcultivo cuando alcanzaron una densidad del 80% al 90%, como se describe a continuación.
- Deseche el medio de cultivo original por aspiración con una pistola de pipeteo y lave las células 2 veces con PBS. Cuando limpie las células adherentes con PBS en una placa de cultivo celular, mueva el PBS a la pared lateral o colóquelo en la placa.
- Después de la aspiración de PBS, agregue 0,5-1 ml de solución de tripsina EDTA al 0,25% a la placa o matraz de cultivo celular. Agite suavemente para cubrir toda la superficie de la célula. Coloque la placa o matraz de cultivo celular en una incubadora a 37 °C durante aproximadamente 1 min o a RT hasta que las células estén redondeadas y separadas. Observa la exfoliación de las células con la ayuda de un microscopio invertido.
- Agregue el mismo volumen de D10 recién formulado para terminar la digestión de la tripsina. Purgue la superficie inferior del matraz de cultivo celular con una pistola de pipeteo para asegurarse de que todas las células estén separadas.
- Transfiera la suspensión de la celda B16F10-GP a un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugue a 163 x g durante 4 min a RT.
- Aspirar el sobrenadante y desecharlo. Vuelva a suspender las células en 1-2 mL de D10 para la precipitación. Transferir la suspensión celular B16F10-GP a una nueva placa o matraz de cultivo celular que contenga 8-10 mL de D10 y luego incubar en una incubadora celular a 37 °C con 5% de CO2.
- El día de la implantación del tumor, recoja las células B16F10-GP con una densidad de aproximadamente el 90 %, como se describe en los pasos 2.1.1 a 2.1.4. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y deséchelo. Resuspender el precipitado celular en 1 mL de PBS.
- Cuente las células viables con un hemocitómetro azul de tripano al 0,4 %. Agregue PBS para diluir la célula a 5 x 105 células por 100 μL. Coloque las células en hielo hasta su uso.
3. Inoculación ectópica de células B16F10-GP en la región inguinal bilateral de ratones
- Aspire 100 μL de suspensión celular B16F10-GP preparada con una jeringa de 1 mL. Mueve la pared del tubo para mover las burbujas hacia arriba y empuja el pistón para mover la burbuja superior hacia afuera.
- Sostén al ratón en posición supina, exponiendo su abdomen. Presione la extremidad trasera derecha del ratón en posición supina con un dedo para que la piel de la región inguinal derecha quede completamente expuesta (lo mismo con la región inguinal izquierda).
- Retire el pelaje del abdomen con crema depilatoria, luego limpie el área bilateral del abdomen con algodón que contenga etanol al 75%.
- Antes de insertar la aguja, asegúrese de que la piel de la región inguinal esté tensa. Inserte la aguja en un ángulo de 45° en el espacio subcutáneo de la región inguinal de la parte superior del muslo. Asegúrese de que la aguja esté biselada hacia arriba y que la profundidad de la aguja sea de 0,5-1 cm.
- Aplique una succión suave antes de la inyección, si no hay sangre, inyecte las células inyectadas lentamente en el tejido subcutáneo. Al mismo tiempo, observe un pequeño bolo (formación de bolsa de líquido) en la región subcutánea.
- Después de la inyección, retire la aguja, colóquela en la caja de objetos punzocortantes y devuelva el ratón a su jaula.
4. Transferencia adoptiva de células T P14 a ratones portadores de tumores
- Realizar la transferencia adoptiva en ratones portadores de tumores 6-8 días después de la implantación del tumor, cuando los tumores son palpables (aproximadamente 3-5 mm de diámetro). Inyectar por vía intraperitoneal 4 mg de ciclofosfamida el día anterior a la transferencia 28,29,30.
NOTA: El objetivo de la inyección de CTX es crear espacio en el compartimento linfático para las células T transferidas de forma adoptiva mediante la eliminación transitoria de los linfocitos proliferantes. - Aislar linfocitos del bazo y LN de ratones transgénicos P14 naïve como se describe a continuación31,32 (6-10 semanas de edad, del mismo sexo que los ratones portadores de tumores para evitar problemas de rechazo).
NOTA: Realice los siguientes procedimientos en una cabina de bioseguridad para garantizar condiciones estrictamente estériles.- Prepare dos platos de 6 cm y agregue 3 mL de medio R2 a uno de los platos y 3 mL de tampón RBL al otro plato. Coloque un filtro celular de 70 μm en la placa de Petri que contiene tampón RBL.
- Eutanasia de ratones P14 en recipientes herméticos que contenían isoflurano seguido de una luxación cervical. Ajuste el número de ratones P14 de acuerdo con el número de ratones receptores.
- Extraiga los ganglios linfáticos del bazo, inguinal y axilar de los ratones sacrificados y transfiéralos a placas de 6 cm que contengan 4 ml de medio R2 y se coloquen en hielo.
- Coloque el bazo en un colador empapado con 3 ml de tampón RBL, muela el bazo con el putter dentro de la jeringa de 1 ml. Incubar las células en RT durante 1-2 min, luego terminar la reacción con 3 mL de medio R2 frío.
- Muele los LN con el putter dentro de la jeringa de 1 ml hasta que solo quede tejido conectivo en el colador con un filtro celular de 70 μm. Enjuague el filtro con medio R2 frío y transfiera la suspensión celular a un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar las muestras a 500 x g durante 6 min a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células con 3 mL de PBS. Utilice un filtro celular de 70 μm para eliminar el material floculante de la suspensión celular.
- Centrifugar la suspensión celular a 500 x g durante 6 min a 4 °C. Vuelva a suspender las células con 3 ml de PBS y coloque el tubo en hielo. Tome una pequeña muestra, mézclela con azul de tripano y cuente las células con una placa de recuento de células sanguíneas.
- Determinar el porcentaje de células P14 (CD45.1+CD8+Vα2+muertas vivas/muertas) mediante citometría de flujo. Asegúrese de que las células del donante transferidas exhiban un marcador congénito distinto con los ratones receptores (los ratones B6 portadores de tumores son CD45.2+). Realice la tinción antes de la transferencia para verificar el fenotipo correcto de las células transferidas.
- Agregue 5 x 104- 1 x 105 celdas a un tubo de centrífuga de 1,5 ml que contenga 1 ml de tampón FACS. Centrifugar la suspensión celular a 500 x g a 4 °C durante 3 min.
- Deseche el sobrenadante, sacuda el fondo del tubo para dispersar las células y coloque el tubo sobre hielo.
- Preparar la siguiente mezcla de anticuerpos conjugados 9,32 diluida en 100 μL de tampón FACS: anti-CD8, 1:200; anti-TCR Vα2, 1:100; anti-CD45.1, 1:200; Mancha viva/muerta, 1:400. (Tabla de Materiales).
- Centrifugar la mezcla de anticuerpos a 15.000 x g durante 3 min para agregar las partículas. Coloque la mezcla sobre hielo y protéjala de la luz envolviéndola en papel de aluminio. Solo tome el sobrenadante para evitar la aspiración de partículas.
- Vuelva a suspender las células en 100 μL de la mezcla de anticuerpos y mezcle bien golpeando la pared del tubo. Después de envolverlo en papel de aluminio, incube el tubo durante 30 minutos en hielo.
- Lave las celdas 2 veces con tampón FACS. Centrifugar el tubo a 500 x g a 4 °C durante 3 min. Vuelva a suspender las células con 200 μL de tampón FACS y transfiera la suspensión celular a un tubo de flujo.
- Ejecute el tubo de flujo con células teñidas en un citómetro de flujo para determinar el porcentaje de células CD45.1+CD8+Vα2+ vivas/muertas.
NOTA: En general, más del 90% de las células T CD8+ de ratones transgénicos P14 albergaban Vα2+TCRs, que son específicos del epítopo H-2Db GP33-41 de LCMV (virus de la coriomeningitis linfocítica).
- Calcule el número absoluto de células vivas/muertas CD45.1+CD8+Vα2+ multiplicando su porcentaje y el número de células vivas obtenido en los pasos 4.2 y 4.3.
- Aspire 200 μL de suspensión de células P14 (5 x 105 células) con una jeringa de insulina de 100 U y elimine las burbujas. El número inicial de células P14 vírgenes transferidas (5 x 103 - 5 x 105) no afectó al fenotipo de las células transferidas9.
- Coloque los ratones en una jaula y caliéntelos con una lámpara infrarroja durante 5-10 minutos para expandir la vena de la cola. Manténgalo en su lugar con un fijador de ratón del tamaño adecuado, enderece la cola y límpiela con una bola de algodón que contenga un 75% de etanol para que las venas sean visibles.
- Inserte la aguja paralela a la vena de la cola y tire suavemente hacia atrás del émbolo. Si hay sangre fluyendo hacia la jeringa, empuje lentamente la suspensión celular hacia la vena.
NOTA: Si hay resistencia o hinchazón de la cola durante la inyección, es necesario ajustar la posición de inyección. El sitio de inyección debe comenzar en el extremo distal. - Una vez completada la inyección, saque la aguja rápidamente y presione suavemente el lugar de la inyección con una bola de algodón. Regrese el ratón a una jaula nueva y limpia y obsérvelo de cerca durante varios minutos para detectar cualquier efecto adverso.
5. Resección del tumor primario
NOTA: Asegúrese de que todos los instrumentos quirúrgicos estén esterilizados en autoclave antes de usarlos. Esterilizar el área de operación dentro de la cabina de bioseguridad con etanol al 75%, seguido de irradiación UV durante al menos 30 min. Use batas, gorros, mascarillas y guantes estériles limpios durante la cirugía.
- Cuando el tumor es palpable (aproximadamente 5 mm de diámetro), se reseca el tumor primario.
- Anestesiar a los ratones con inyección intraperitoneal de ketamina (75 mg/kg). Pellizque la almohadilla del pie para evaluar el grado de anestesia, si no hay reflejo de dolor, indica el momento adecuado para la cirugía. Si se retiraron las extremidades posteriores, administrar otra dosis de 10-30 μL.
NOTA: Alternativamente, la medetomidina intraperitoneal (1 mg/kg de peso corporal; Domitor) se recomienda para anestesiar ratones. - Aplique la pomada preventiva secante en los ojos del ratón. Retire el pelo del abdomen con crema depilatoria para exponer completamente el campo quirúrgico.
- Coloque el ratón en una cabina de bioseguridad y colóquelo sobre una tabla anatómica cubierta con papel absorbente limpio en posición supina para que el eje longitudinal del ratón quede paralelo al experimentador.
NOTA: Para mantener un ambiente estéril estricto, los siguientes procedimientos deben realizarse en un gabinete de bioseguridad. - Desinfectar el abdomen de los ratones con un algodón empapado en povidona yodada. Incida la piel cerca del sitio con tumor con un bisturí estéril o unas tijeras oftálmicas. Inserte la punta de la tijera cerrada en la incisión para exponer claramente el tumor. Al incidir la piel, asegúrese de no dañar los ganglios linfáticos inguinales.
- Durante la extirpación del tumor, mantenga la cápsula lo más intacta posible. Extirpe con cuidado y cuidado el tejido conectivo adyacente al tumor con unas tijeras estériles. Extirpar el tumor in situ por completo, de lo contrario puede reaparecer.
6. Inyección intraganglionar de células B16F10-GP en el ganglio linfático inguinal
NOTA: Después de la eliminación bilateral del tumor, se inyectaron células B16F10-GP en el ganglio linfático inguinal unilateral y se inyectó PBS en el otro lado.
- Aspire 20 μL (5 x 104 células) de suspensión de células B16F10-GP con una jeringa de insulina de 100 U, retire las burbujas y luego inyéctelas en un ganglio linfático inguinal. Inyecte un volumen igual de PBS en el ganglio linfático inguinal del otro lado.
- Durante la inyección, inserte la aguja desde el extremo distal del ganglio linfático y luego inserte lentamente la aguja en el centro del ganglio linfático. En este momento, si el líquido se inyecta con precisión en el ganglio linfático, se puede ver que el ganglio linfático se hincha significativamente.
NOTA: Cuando la aguja se inserte desde el extremo distal del ganglio linfático, asegúrese de no perforar el ganglio.
- Durante la inyección, inserte la aguja desde el extremo distal del ganglio linfático y luego inserte lentamente la aguja en el centro del ganglio linfático. En este momento, si el líquido se inyecta con precisión en el ganglio linfático, se puede ver que el ganglio linfático se hincha significativamente.
- Suturar la incisión con 2-3 puntos de sutura usando una sutura 3-0. Desinfectar la piel que rodea la herida con algodón impregnado de povidona yodada. Tenga cuidado de evitar los ganglios linfáticos durante la sutura.
- Coloque el ratón en una jaula limpia y manténgalo caliente con luz infrarroja en la posición de decúbito lateral. Monitoree continuamente hasta que recupere la conciencia. Asegúrese de que los ratones que se han sometido a la cirugía no sean devueltos a la compañía de otros animales hasta que estén completamente recuperados.
- Administrar buprenorfina cada 4-6 h durante 3 días consecutivos después de la operación para aliviar el dolor postoperatorio (a dosis de 0,1-0,5 mg/kg, SQ o IP). Controle las áreas de alimentación, bebida, movimiento y actividad de los ratones. Por lo general, los ratones se recuperan del trauma quirúrgico en 3 días.
NOTA: Si los ratones no pueden reanudar la alimentación y las actividades normales y muestran signos de infección, consulte a un veterinario para que intervenga o practique la eutanasia. - Sacrificar ratones en diferentes momentos: el día 8 y el día 18 después de la inyección intraganglionar de células tumorales. Recupere las células del donante activadas mediante el análisis de citometría de flujo.
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Representative Results
El diagrama esquemático de este diseño experimental se muestra en la Figura 1A. Un total de 5 x 105 células B16F10-GP en 100 μL de PBS se implantaron por vía subcutánea (s.c.) en la región inguinal bilateral de ratones CD45.2 C57BL/6J. Después de 7 días, estos ratones portadores de tumores fueron inyectados por vía intraperitoneal (i.p.) con 4 mg de CTX, seguido de la transferencia adoptiva de 5 x 105 células CD45.1+P14 a través de la inyección intravenosa (i.v.) en la cola. Cuando los tumores crecieron hasta aproximadamente 3-5 mm de diámetro (aproximadamente 7 días después de la transferencia de células P14), se resecaron los tumores primarios y se inyectaron directamente 5 x 104 células B16F10-GP en 20 μl de PBS en el ganglio linfático inguinal unilateral. Al ganglio linfático inguinal del otro lado se le inyectaron volúmenes iguales de PBS. En la Figura 1B se muestra la tinción representativa de hematoxilina y eosina (H&E, 100x) de los ganglios linfáticos no metastásicos (nLN) y los ganglios linfáticos metastásicos (mLN) en los momentos indicados. La estructura de nLN estaba intacta. En la etapa temprana de la metástasis de LN (D8), mLN estaba parcialmente ocupada con células tumorales (flecha negra), y todavía queda un área con linfocitos que no han sido invadidos por células tumorales (flecha roja). Mientras que en la etapa tardía de la metástasis de LN (D18), mLN está llena de células tumorales acompañadas de angiogénesis tumoral y pocos linfocitos. Las células P14 activadas recuperadas en TdLN produjeron un alto nivel de IFN-γ después de la estimulación del péptido GP33-41 9,31. Aquí, los porcentajes de células P14 activadas se analizaron mediante citometría de flujo en diferentes puntos de tiempo y la estrategia de activación se muestra en la Figura 2. La frecuencia de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno en sangre periférica en la etapa temprana (D8) y tardía (D18) es del 2,81% y 1,48%, respectivamente (Figura 3A). Se ha informado que las células T CD8+ específicas del tumor residen estrictamente en dLN durante la tumorigénesis y que las células de donantes limitadas recuperadas sin drenaje de LN33. El porcentaje de células P14 específicas de antígeno en la nLN se mantuvo estable durante la metástasis de la LN. Curiosamente, las células T CD8+ específicas de antígeno en mLN se potenciaron transitoriamente en la etapa temprana, lo que se evidencia por la mayor frecuencia de células P14 en comparación con nLN, mientras que disminuyó drásticamente en la etapa tardía (Figura 3B).
Figura 1: Diagrama esquemático del diseño experimental. (A) A los ratones C57BL/6J (CD45.2+) se les implantan 5 x 105 células tumorales B16F10-GP en la región inguinal bilateral. Después de 7 días, estos ratones se inyectan intraperitonealmente con 4 mg de CTX, y luego se realiza la transferencia adoptiva de diferentes células P14 marcadas congénicamente (CD45.1+) al día siguiente. Cuando los tumores crecen hasta aproximadamente 3-5 mm de diámetro (aproximadamente 7 días después de la transferencia de células P14), se resecan los tumores primarios, luego se inyectan directamente 5 x 104 células B16F10-GP en 20 μL de PBS en el ganglio linfático inguinal unilateral, y el ganglio linfático inguinal del otro lado se inyecta con volúmenes iguales de PBS. (B) Tinción representativa de hematoxilina y eosina (H&E, 100x) de las LN. Abreviaturas: s.c. = subcutánea; CTX= ciclofosfamida; i.v. = intravenoso; Saco = sacrificio; nLN = LN no metastásico; mLN = LN metastásico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Estrategia de compuerta para el análisis de citometría de flujo. Estrategia de activación utilizada para identificar linfocitos T CD8+ específicos de antígeno activado derivados de donantes. Abreviaturas: L/D = vivo/muerto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Dinámica de las células T CD8+ específicas de antígeno durante la metástasis de LN. Proporción de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno en (A) sangre periférica, (B) nLN y mLN en diferentes momentos. Abreviaturas: nLN = LN no metastásico; mLN = LN metastásico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Durante la tumorigénesis, las células presentadoras de antígenos (APC, por sus siglas en inglés) engullen a los antígenos tumorales y migran a TdLN, donde preparan las células T CD8+. Después del cebado y la activación, las células T CD8+ abandonan la TdLN y se infiltran en el tumor para destruir las células tumorales. A través de la resección de TdLN y la administración de FTY720 que bloquea la salida de las células inmunitarias de los órganos linfoides, varios estudios han demostrado el papel fundamental de TdLN para garantizar la eficacia de la terapia de puntos de control PD-1/PD-L134,35. De acuerdo con esto, recientemente descubrimos que las células T CD8+ de memoria específicas del tumor (TTSM) residen predominantemente en TdLN, estas células TdLN-TTSM sirven como respondedores de buena fe a ICB9. Desafortunadamente, varios tipos de células cancerosas a menudo se diseminan a las TdLN desde los sitios del tumor primario, lo que conduce a la reconfirmación estructural y a la disfunción de las células inmunitarias en las TdLN. Ya se ha descrito el deterioro de la cantidad y calidad de los linfocitos T CD8+ en las mLN20,36. Sin embargo, no se han dilucidado los cambios dinámicos de los linfocitos T CD8+, especialmente los linfocitos T CD8+ específicos del antígeno tumoral durante la cascada metastásica de LN.
Aquí, desarrollamos un modelo de ratón conveniente para monitorear la dinámica de las células T CD8+ específicas de antígeno sistémico y local durante el proceso de metástasis de LN. Las células de melanoma B16F10-GP se implantaron por vía subcutánea en la región inguinal bilateral, seguidas de una transferencia adoptiva con células P14 que pudieron ser activadas específicamente por el péptido derivado de GP GP33-41. En el día 7 después de la transferencia celular, cuando las células P14 en las LN inguinales se activaron por completo, se resecaron los tumores primarios en ambos lados y las células B16F10-GP se inyectaron directamente en la LN inguinal unilateral, se realizó una operación simulada en el otro lado a través de la inyección con volúmenes iguales de PBS. Este ingenioso diseño permite la comparación de células P14 en mLN y LN no metastásico (nLN) dentro de los mismos ratones. Simultáneamente, las células P14 en la sangre de la periferia dentro de los mismos ratones se detectaron en diferentes puntos de tiempo durante la metástasis de LN mediante el sangrado de la vena orbitaria. Aparte de las frecuencias de células P14 en la sangre periférica y de las TdLN en diferentes estadios durante la metástasis de la LN, las propiedades transcripcionales y epigenéticas de estas células T CD8+ específicas de antígeno podrían examinarse más a fondo con otras técnicas.
Cabe destacar que varios pasos deben realizarse con precaución. En primer lugar, los tumores primarios deben extirparse a fondo, ya que las células tumorales residuales volverían a crecer rápidamente. En segundo lugar, la operación debe realizarse con cuidado, ya que los tejidos tumorales contienen abundantes vasos sanguíneos nuevos que generalmente se rompen inevitablemente durante la resección del tumor primario y conducen a la muerte de los ratones quirúrgicos debido a una hemorragia masiva. Por lo tanto, el momento de la resección del tumor primario es de vital importancia. Por lo general, es relativamente seguro extirparlo cuando el tumor crece hasta alcanzar un tamaño de aproximadamente 5 x 5 mm, y las células tumorales deben inyectarse con precisión en la LN en lugar de en la parte inferior o en los tejidos adyacentes. Además, el volumen de las suspensiones de células tumorales debe controlarse por debajo de 20 μL, de lo contrario el derrame formaría un nuevo tumor fuera de la LN. Por último, una limitación de este protocolo es que la operación es traumática y los ratones pueden experimentar una infección durante el proceso de curación, lo que afectaría a las propiedades de los linfocitos T CD8+ específicos de antígeno. Por lo tanto, es de vital importancia mantener una asepsia estricta durante la cirugía y se debe realizar una inyección de PBS operada de forma simulada para excluir el impacto del daño físico inducido por la inyección en las células T CD8+ específicas del antígeno.
En general, proporcionamos un modelo conveniente para investigar las células T CD8+ específicas del antígeno durante la metástasis de LN y también se podrían dilucidar las interacciones entre las células T CD8+ específicas del antígeno y otras células inmunitarias o células del estroma durante la metástasis de la LN. Además, podría extenderse fácilmente a varios otros modelos tumorales. En conjunto, este protocolo ofrece un modelo reproductivo útil para el estudio de la inmunología del cáncer.
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Disclosures
Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias para Jóvenes Académicos Sobresalientes de China (n.º 82122028 a LX), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (n.º 82173094 a LX), la Fundación de Ciencias Naturales de Chong Qing (n.º 2023NSCQ-BHX0087 a SW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
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