Eine effiziente und reproduzierbare Methode zur Herstellung von Kompositpflanzen durch Agrobacterium rhizogenes-basierte Haarwurzeltransformation
Summary
Hier stellen wir das detaillierte Protokoll einer einstufigen Transformationsmethode zur Verfügung, die durch Agrobacterium tumefaciens zur Herstellung von Mischpflanzen vermittelt wird.
Abstract
Die Produktion von Kompositpflanzen mit transgenen Wurzeln und nicht-transgenen Stängeln und Knospen unter Verwendung der durch Agrobacterium rhizogenes vermittelten haarigen Wurzeltransformation ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der wurzelbezogenen Biologie. Die Haarwurzeltransformation ist bei einer Vielzahl von Dikotyledonen und bei mehreren Monokotyledonenarten etabliert und nahezu unabhängig vom Genotyp. Die traditionelle Methode der Hypokotylinjektion mit A. rhizogenes zur Gewinnung von Mischpflanzen ist ineffizient, zeitaufwändig, mühsam und führt häufig zum Absterben zarter und winziger Hypokotylpflanzen. Zuvor wurde eine hocheffiziente, einstufige Haarwurzeltransformation etabliert, die durch A. rhizogenes vermittelt wird und die ein Umtopfen nach der Produktion von Haarwurzeln überflüssig macht. In dieser Studie wurden ein Teil der Hypokotyl- und Primärwurzel entfernt, die Hypokotyl-Inzisionsstelle wurde mit A. rhizogenes beschichtet und dann wurden Hypokotyle in sterilen Vermiculit gepflanzt. Nach 12 Tagen Kultivierung dehnte sich der Hypokotylschnitt aus und es wurden neue behaarte Wurzeln induziert. Dieser Artikel enthält das detaillierte Protokoll einer einstufigen Transformationsmethode, die durch A. rhizogenes vermittelt wird und deren Wirksamkeit durch die Herstellung von Mischpflanzen aus wilder Sojabohne, Solanum americanum und Kürbis nachgewiesen wurde.
Introduction
Agrobacterium rhizogenes ist ein gramnegatives Bodenbakterium aus der Familie der Rhizobiaceae. A. rhizogenes kann fast alle Dikotyledonen, einige wenige Monokotyledonen und einzelne Gymnospermen durch Wunden infizieren und behaarte Wurzeln in infizierten Pflanzen produzieren. Das Bakterium trägt das Ri-Plasmid (wurzelinduzierend), und die T-DNA des Ri-Plasmids trägt das Gen für die Oppinsynthese und die Rollengene (Gene des Wurzellocus). Nachdem die T-DNA des Ri-Plasmids in eine Pflanzenzelle eingedrungen und in ein Wirtschromosom integriert wurde, induziert die Expression der Rollengene die Produktion von Haarwurzeln1. Ein binärer Expressionsvektor einer Pflanze, der ein Zielgen trägt, wird in A. rhizogenes umgewandelt, und der transformierte A. rhizogenes wird verwendet, um eine Pflanze zu infizieren. Transgene Wurzeln können in infizierten Pflanzen induziert werden, wodurch zusammengesetzte Pflanzen entstehen, die transgene Wurzeln und nicht-transgene Stängel und Knospen enthalten. Im Allgemeinen kann eine zusammengesetzte Pflanze innerhalb von 14-20 Tagen erhalten werden. Die A. rhizogenes-vermittelte Haarwurzeltransformation ist bei zweikeimblättrigen Pflanzen im Allgemeinen nicht durch den Genotyp begrenzt2. Die behaarten Wurzeln, die von A. rhizogenes-infizierten Pflanzen produziert werden, zeichnen sich durch eine schnelle Wachstumsrate, eine stabile Vererbung und eine einfache Bedienung aus. Die Transformation von Haarwurzeln, die durch A. rhizogenes vermittelt wird, wird derzeit häufig zur Untersuchung der wurzelbezogenen Biologie verwendet. Darüber hinaus kann die Transformation von Haarwurzeln auch dazu verwendet werden, die Effizienz des CRISPR/Cas9-Systems 3,4,5 und der subzellulären Lokalisierung von Proteinen zu validieren und zu optimieren. Daher ist die Transformation von Haarwurzeln ein wichtiges Werkzeug in der Erforschung der Funktion von Pflanzengenen, des Metabolic Engineering und der Wechselwirkungen zwischen Wurzeln und Mikroorganismen der Rhizosphäre 6,7,8.
Kompositpflanzen mit transgenen Wurzeln, die durch Haarwurzeltransformation gewonnen werden, sind in zweikeimblättrigen Pflanzen, insbesondere in Hülsenfrüchten, weit verbreitet. Die traditionelle Methode der Injektion von A. rhizogenes in das Hypokotyl wurde verwendet, um zusammengesetzten Lotus corniculatus9, Sojabohnen10, Tomaten11, Süßkartoffeln12 und viele andere Pflanzen zu produzieren 5,8. Die Hypokotyl-Injektionsmethode ist ineffizient und führt wahrscheinlich zum Absterben junger oder winziger Hypokotylpflanzen. Daher wurde die Methode verbessert, indem die embryonalen Wurzeln abgeschnitten, der Keimlingsschnitt mit A. rhizogenes beschichtet und dann das Hypokotyl auf steriles Nährmedium für die Bewurzelungskultivierung gelegtwurde 13. Diese Schritte werden jedoch in einer sterilen Umgebung durchgeführt, und die Operationsschritte sind relativ umständlich. Insbesondere die entstehenden Mischpflanzen müssen umgepflanzt werden, was den Arbeitsaufwand erhöht. In früheren Arbeiten wurde eine einstufige A. rhizogenes-vermittelte (ARM) Haarwurzeltransformation in Gurken, Sojabohnen, Lotus japonicus, Medicago truncatula und Tomaten etabliert 2,14,15,16,17. Die Primärwurzel und ein Teil des Hypokotyls wurden entfernt, die Inzisionsstelle des verbleibenden Hypokotyls wurde mit transformiertem A. rhizogenes beschichtet und der Keimling wurde dann in feuchten, sterilen Vermiculit gepflanzt. Nach 12 Tagen Kultivierung wurden an der Inzisionsstelle behaarte Wurzeln gebildet. Die einstufige ARM-Methode ist hocheffizient und benötigt weniger Zeit, um behaarte Wurzeln zu produzieren. Auch ein Umtopfen nach der Bildung von Haarwurzeln ist nicht notwendig. Da eine mikrobielle Kontamination ohne Transplantation vermieden werden kann, kann die einstufige ARM-Methode besonders nützlich sein, wenn es darum geht, Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikroorganismen zu untersuchen, wie z. B. die symbiotische Stickstofffixierung zwischen Leguminosen und Rhizobien sowie Symbiosen zwischen Pflanzen und arbuskulären Mykorrhizapilzen. In dieser Arbeit wird ein detailliertes einstufiges A. rhizogenes-vermitteltes Haarwurzel-Transformationsprotokoll mit Beispielen von Kompositpflanzen aus wilder Sojabohne, Solanum americanum und Kürbis vorgestellt. Mit dem Protokoll können Forscher die einstufige ARM-Transformation reibungslos durchführen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die einstufige A. rhizogenes-vermittelte Haarwurzelmethode ist eine einfachere und effizientere Methode zur Herstellung von Mischpflanzen als die Hypokotyl-Injektionsmethode. Die einstufige ARM-Methode verbessert die Effizienz der Haarwurzeltransformation erheblich, verkürzt die Zeit bis zur Herstellung von Haarwurzeln, erhöht die Anzahl der Haarwurzeln und reduziert den Arbeitsaufwand. Das verbesserte Transformationsprotokoll ist optimal für Studien zu Symbiosen zwischen Leguminosen und Rhizobien sowie zwisc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Forschungsfonds der Universität Liaocheng (318012028) und der Natural Science Foundation der Provinz Shandong (ZR2020MC034) unterstützt.
Materials
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
| plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| pumpkin | local variety Yinsu | ||
| streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
References
- Chilton, M. D., et al. Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genome of the host plant root cells. Nature. 295, 432-434 (1982).
- Fan, Y., et al. A fast, simple, high efficient and one-step generation of composite cucumber plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). 141, 207-216 (2020).
- Du, H., et al. Efficient targeted mutagenesis in soybean by TALENs and CRISPR/Cas9. Journal of Biotechnology. 217, 90-97 (2016).
- Nguyen, D. V., et al. An efficient hairy root system for validation of plant transformation vector and CRISPR/Cas construct activities in cucumber (Cucumis sativus L.). Frontiers in Plant Science. 12, 770062 (2022).
- Liu, S., et al. AtGCS promoter-driven clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 highly efficiently generates homozygous/biallelic mutations in the transformed roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 952428 (2022).
- Irigoyen, S., et al. Plant hairy roots enable high throughput identification of antimicrobials against Candidatus Liberibacter spp. Nature Communications. 11 (1), 5802 (2020).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2016).
- Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).
- Stougaard, J. Agrobacterium rhizogenes as a vector for transforming higher plants. Application in Lotus corniculatus transformation. Methods in Molecular Biology. 49, 49-61 (1995).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).
- Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Methods. 14, 34 (2018).
- Yu, Y., et al. Overexpression of phosphatidylserine synthase IbPSS1 affords cellular Na+ homeostasis and salt tolerance by activating plasma membrane Na+/H+ antiport activity in sweet potato roots. Horticulture Research. 7, 131 (2020).
- Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 14 (6), 695-700 (2001).
- Fan, Y., et al. One-step generation of composite soybean plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. BMC Plant Biology. 20 (1), 208 (2020).
- Fan, Y., et al. Anthocyanin, a novel and user-friendly reporter for convenient, non-destructive, low cost, directly visual selection of transgenic hairy roots in the study of rhizobia-legume symbiosis. Plant Methods. 16, 94 (2020).
- Wang, X., et al. Application of AtMYB75 as a reporter gene in the study of symbiosis between tomato and Funneliformis mosseae. Mycorrhiza. 33 (3), 181-185 (2023).
- Wang, X., et al. Development of a set of novel binary expression vectors for plant gene function analysis and genetic transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 1104905 (2023).
- Li, Q. Q., et al. Phytochrome B inhibits darkness-induced hypocotyl adventitious root formation by stabilizing IAA14 and suppressing ARF7 and ARF19. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 105 (6), 1689-1702 (2021).
