用新型声学微发射器植入幼年美国鲱鱼的处理和标记技术

Summary

本文提供了最佳处理实践的详细程序，并将声学微型发射器植入幼年美国鲥鱼中。我们的实验室研究结果表明，这些标记技术可以用于幼年美洲鲱鱼的实地研究，存活概率很高。

Abstract

使用遥测技术来更好地了解美国鲥鱼幼鱼（Alosa sapidissima）在水电系统中迁移时的行为和生存情况一直具有挑战性，因为众所周知，鲱鱼对处理特别敏感。本研究的目的是使用一种新的声学微型发射器开发一种标记协议，以最大限度地减少标记过程的不利影响，并最大限度地提高美国鲥鱼幼鱼的标记后存活率。在标记前后限制出水处理和使用咸盐水（千分之 7.5）可提高使用简单胸腔植入方法标记的鲥鱼的存活率。该协议提供了一个详细的分步程序，用于用声发射器标记幼鲥鱼。使用该程序标记并在实验室中保存 60 天的鱼的存活率为 81.5%，而未标记的鱼的存活率为 70%。本研究中开发的成功的标记和处理方法可应用于幼鲥和其他敏感物种的野外遥测研究。

Introduction

美洲鲥鱼（Alosa sapidissima）是一种溯河鱼类，原产于美国东海岸。生境可用性的减少和水电大坝的开发增加导致鲱鱼在其原生范围内的数量下降 ^1,2。幼鲥和其他海藻在向海洋迁徙时，在通过水力发电结构时可能特别容易受到伤害和死亡^3,4,5。了解水电站大坝中鲱鱼幼鱼的通过率和存活率对于为这些设施的重新许可以及该物种的恢复工作提供信息至关重要。然而，缺乏成功的标记技术来评估美洲鲱鱼在迁移到海洋时的通过率和存活率。用发射机标记用于遥测研究的沙德应代表未标记的推理群体，并且不应受到标记或标记过程^{的负面影响6,7}。

为了帮助提高追踪幼鲥鱼的能力，西北太平洋国家实验室（PNNL）开发了一种新的声学微型发射器，用于研究美洲鲥鱼和其他具有相似压缩体型的鱼类。研究美洲鲱鱼和其他海芥鱼的常见挑战之一是与其他物种相比，它们对处理、运输和标记的敏感性。例如，Raquel等人⁸ 发现，在他们的研究中，美国鲱鱼幼鱼的装卸和卡车运输死亡率一直高于其他五种幼鱼。在为数不多的已发表的评估美国鲱鱼幼鱼标签努力的研究中，已经报告了广泛的存活率，从标记后 7 天后低至 2%⁹ 和标记后 48 小时后高达 100%¹⁰ ，关于标记的幼鲥鱼的长期存活率和递质保留的信息很少。

成功处理和标记敏感物种（如美洲鲱鱼）的挑战揭示了有关其迁徙、行为和栖息地利用的知识差距。跟踪水电站大坝运动的能力将大大促进对美洲鲱鱼的通行和存活率的理解。这将有助于为现有水力发电设施的管理决策提供信息，并为系统设计提供新颖的设计，以尽量减少对以前未研究过的鱼类和生命阶段的影响。随着新的变质机技术的发展，了解变质和标记过程的影响对于最大限度地减少偏差并准确评估传代和存活率至关重要。本研究的目的是评估用新的声学微型发射器标记的幼年美国鲥鱼的 60 天存活率，并提供一种处理和标记协议，以减少标记对鲥鱼的负面影响，从而使它们与未标记的鲥鱼更具可比性。

Protocol

PNNL获得了实验动物护理评估和认证协会的认可。美洲鲱鱼是按照联邦实验室动物护理和使用指南11处理的，我们研究的方案是按照PNNL的机构动物护理和使用委员会进行的，并得到了批准。 1. 贴标后回收罐的准备 当咸盐水（7.5 ppt）不容易获得时，使用静态系统在释放前将鲥鱼保持适当的曝气和循环1-2天（图1）。 在静态的圆形水箱中，安装一个空气提升系统以提供曝气。将 PVC 管连接到水箱的侧面，使一个三通位于顶部，另一个三通位于中间附近，并将屏蔽接头拧到管道底部。 接下来，将空气石连接到压缩空气管路，并将空气石放置在靠近屏幕的管道底部。注意： 屏幕可防止鱼游入空运系统。 用淡水填充水箱，直到空运的出口（中间 PVC 三通）大约淹没一半。然后，关掉水。接下来，打开并增加空气供应，直到从端口流出的充气水为鱼定向形成定向流动。 加入商业海盐制成 7.5 ppt 微咸水溶液，搅拌至溶解。 2.盐水鱼源桶及盐水麻醉液的制备 每 0.5 升水量取 7.5 克海盐，然后溶解在桶中。注意：在步骤3.5中，加入等体积的含有鲥鱼的淡水，以产生7.5ppt的最终浓度。 在另一个桶中，测量并溶解每升水 7.5 克海盐。每升盐水加入 120 mg 甲磺酸三卡因 （MS-222），用 120 mg 碳酸氢钠缓冲。 在麻醉桶中添加补充空气。 3. 通过水对水转移到咸水中收集鲥鱼 将另一个桶部分装满淡水，并将其侧向放入预标记源水箱中。 用网或手轻轻地引导鲥鱼游进桶里。 一旦桶中有适当数量的鱼，将桶直立转动，并用穿孔盖固定。 通过盖子倒出多余的水，将鱼保持在目标淡水量中（即最终 7.5 ppt 盐水源桶体积的一半）。 轻轻地将鲥鱼和淡水倒入步骤2.1中制备的盐水源桶中。注意：最终盐度为 7.5 ppt。 使用水族箱气泵和空气石为预标记鱼源桶提供补充空气，以将溶解氧保持在可接受的水平（>90% 饱和度是理想的）。 4. 在鲥鱼中植入声发射器 在70%乙醇中对变送器进行消毒20分钟，并在使用前用无菌水冲洗。 使用带有光滑、超细网眼 （~0.4 mm） 的浸网，将鱼从源桶中网入麻醉桶。鲥鱼应在~2-3分钟内失去平衡和脊髓反射，具体取决于水温和其他水质参数。 一旦完全麻醉到第四阶段12，用戴手套的手轻轻地将鱼放在湿测量板上以获得其长度。 将鱼移入装满水的称重船上，放在去皮秤上以获得其重量。 在标记之前记录长度和重量、声学标签代码以及对鱼状况的任何评论，例如鳞片丢失或出血。 将鱼放入装满麻醉盐水的转运容器中，并将其与声发射器一起交付给鱼类外科医生。 将鱼左侧朝下放在带有V型槽的湿防水泡沫垫上（图2A）。注意： V 型槽可防止鱼在手术过程中滑动过多，并允许水在鱼嘴周围积聚，以便它可以主动将水吸到鳃上。 通过连接到重力供水水库的管道向鱼嘴供应淡水。 使用消毒或全新的 #11 不锈钢手术刀片，在胸鳍远端附近的肌粒之间垂直切开一个 3 毫米长的切口。 如果需要，如果刀尖上的鳞片阻碍了鱼的皮肤，请将其取下。小心地将发射器插入切口并将其向后推，直到整个标签位于体腔内（图 2B）。 如果需要，使用手术刀的钝端（或细尖镊子）小心地将标签完全插入。 将标记的鱼放入装有 7.5 ppt 盐水的小容器中，并通气，让鱼从麻醉中恢复。 一旦鱼恢复平衡，从回收容器到装有 7.5 ppt 盐水的贴标后储罐进行水对水转移。 在释放前，让标记的鱼在盐水中恢复 1-2 天。

Representative Results

为了解决标记幼鲥鱼的功效，进行了两个系列的标记评估——2020 年的初步试验和 2021 年的长期保留研究。PNNL 于 2020 年 11 月进行了初步实验室评估，以确定用新型声学微型发射器植入美国鲥鱼的首选方法。原型发射器设计（n = 4，P1-P4）与不同的标记位置（胃、胸、骨盆和背部）配对，总共有 4 个独特的声学发射器标记位置处理（每个处理 n = 40 条鱼， 表 1）。所有测试鱼被随机分配到处理和储存池中。将测试鱼保存在 2 个储水槽中，每个水箱的鱼数量相等（即每次处理 20 条鱼），持续 14 天。在评估的前 2 天，将鲥鱼保存在咸水 （7.5 ppt） 中，并从标记和处理中恢复。然后，在评估期的剩余时间里，将水箱切换为流通淡水。 在初步评估中，标记鱼和鳍夹对照的叉长范围为50-80毫米。与其他标记技术相比，通过胸切口植入的鱼的幼鱼存活率和标签保留率最高（图3）。其他试点评估还表明，在应激事件（如标记）之前和之后，水对水转移和将鱼保持在咸咸水中的处理技术对于提高存活率至关重要。 2021 年，PNNL 利用初步评估中成功的标记和处理方案进行了一项实验室研究，以评估使用胸切口标记方法植入声发射器的幼年美国鲥鱼的长期 60 天存活率和标签保留率。长期评估使用了虚拟发射机 P5（图 4），这是一种改进的原型设计，在形式和尺寸上与初步评估中使用的 P1 设计相似。假人 P5 标签的平均尺寸和重量为 7.6 毫米长×直径 2.3 毫米，空气重量为 0.058 克（标准差 0.002 克），导致标签负担为 <1%。带有功能组件的原型声学发射器（图 4）的尺寸为 7.6 mm 长 x 2.0 mm 直径，空气重量为 0.050 g。 在测试时，用于长期评估的幼年美国鲱鱼已被圈养了4个月。虽然该实验旨在将相同数量的处理和对照鱼保存在两个水箱中 60 天，但在标记时剩余的鲥鱼数量很少。因此，与对照组相比，标记治疗组随机分配了更多的鲥鱼，以更好地了解标记技术对鲥鱼的长期疗效。两个水箱中的每一个都装有27条处理鱼和9或10条对照鱼。然而，由于坦克A（13.8%）的存活率明显低于坦克B（78.4%;Fisher 精确检验， p < 0.001），每个罐内标记组和对照组之间的存活率没有差异，此处仅包括罐 B 的结果。 鲱鱼（叉长69-105毫米;重量3.9-11.7克）使用胸切口（n = 27）用P5发射器标记或分配到对照组（n = 10）。对照鱼使用相同的程序进行处理，包括将鱼放在手术垫上~20秒，但它们没有接受鳍夹或切口，也没有植入发射器。标记后，两个处理组在咸水（7.5 ppt）中保持1天，然后在研究的剩余时间内切换到流经河水。标记组的60天生存率为81.5%，未标记组的生存率为70%（图5）。在该评估中，标记鱼的存活率被定义为存活率和标签保留率，因为在遥测研究中，标签清除与死亡事件无法区分。两组间生存率无统计学差异（Fisher 精确检验， P = 0.884）;然而，由于样本量小，检测差异的功效为 38.4%。尽管检测处理之间差异的功效很低，但长期评估的结果表明，这种处理和标记方案可以以适度的成功用于将美国鲱鱼植入声发射器。 图 1：装满苦咸盐水的贴标后回收罐。 空气提升系统向静态储罐供应氧气。 请点击这里查看此图的较大版本. 图2： 幼年美国鲥鱼的声发射器植入。 幼年美国鲥鱼 （A） 胸切口和 （B） 假 P5 发射器插入切口。请注意，鲥鱼的嘴部分浸没在从蓝色管中流出的水中。 请点击这里查看此图的较大版本. 图 3： 一组未标记对照组和四组标记的幼年美国鲥鱼的初步 14 天评估的存活率。 标记处理由四个标记位置（胃、胸、盆和背）组成，每个位置都与一个独特的递质原型 （P1-P4） 配对。标记鱼的存活率被定义为存活率和标签保留率。 请点击这里查看此图的较大版本. 图4： 用于标记幼年美国鲥鱼的声学和假发射器。 （A）功能性声学微型发射器和（B）用于60 d实验室生存研究的虚拟P5原型发射器。请注意，尺子上的数字 4-7 代表厘米。 请点击这里查看此图的较大版本. 图 5： 美国鲥鱼在长期 60 天保持研究中的存活率。 幼鲥鱼要么未标记（未标记对照组;实线），要么用假发射器标记（标记 [胸 P5];虚线）。标记组的存活率被定义为存活率和标签保留率。 请点击这里查看此图的较大版本. 标签类型 标签位置 N 货叉长度 （mm） 平均标签权重 （SD; g） 标签负担 （%） 生存率 （%） 标记/剪辑的平均时间 范围 平均值 （SD） 小一 胃的 40 50 – 76 60 (6.0) 0.058 (0.003) 1.5 – 5.2 45 12 小二 胸的 40 50 – 78 60 (7.3) 0.039 (0.001) 1.0 – 3.2 80 23 小三 盆腔 40 50 – 70 58 (5.3) 0.039 (0.001) 1.0 – 4.1 55 26 小四 背的 40 50 – 80 61 (6.8) 0.088 (0.004) 0 60 57 控制 NA （夹子） 40 50 – 80 59 (5.7) 那 0 92.5 14 表1：作为初步评估的一部分，植入原型发射器（P1-P4）或用上尾鳍和下尾鳍夹（对照）标记的美国鲥鱼的标记和生存信息。对照组的标签位置不适用 （NA），因为这些鱼只收到鳍夹 （Clip）。请注意，标签类型 P4 是中性浮力设计。均值的标准差 （SD） 列在括号中。

Discussion

研究美国鲱鱼幼鱼在水电设施周围的运动需求促使制定了处理和标记协议，以提高标记鲥鱼的存活率。在PNNL，最初尝试在不使用盐水的情况下用新型声发射器植入幼鱼，结果在24小时内死亡率达到100%。随后精心制定的处理和标记方案表明，美洲鲱鱼可以植入声学微发射器，并在实验室环境中长期保存，存活率高（81.5%）。在标记之前和之后尽量减少出水处理和使用咸咸水对于成功标记幼年美国鲱鱼至关重要。

在初步评估中，使用四种植入方法用假发射器标记小至 50 毫米的鲥鱼。胃标记是标记成年鲥^{鱼 13、14、15} 的最常见方法之一，在试点测试期间取得了有希望的结果，但在初步评估期间标签丢失的发生率很高。通过骨盆切口植入已成功用于研究成年 Twaite 鲥鱼的运动¹⁶ ，背部附件已用于对幼年美国鲥鱼的短期监测¹⁰。最近，通过胸切口植入标签用于研究成年鲱鱼在河流和海洋环境中的长期运动¹⁷。在 PNNL 的初步评估中，胸廓切口位置的表现优于其他三个评估位置，7 天标记后生存率超过 90%。

总体而言，这些评估的结果表明，标记鲥鱼的存活率与未标记鲥鱼的存活率相当，超过声学发射器电池寿命的持续时间，预计为~30天，每5秒传输一次声音信号。

这种发射器设计和标记协议在野外应用中研究小型、敏感和受威胁的鱼类（如美洲鲥鱼）方面显示出巨大的前景，使研究人员能够获得有关水力发电设施附近鱼类运动的宝贵信息。例如，这种标记技术将用于即将到来的现场应用，以研究声学标记的幼鲥鱼在接近水电大坝的溢洪道和发电站时的行为。从河内研究中获得的结果可以更好地为这些设施的管理决策提供信息，并有助于保护该物种的整个幼年生命阶段。未来的研究应评估该程序在野外条件下标记和跟踪径流鱼类的有效性。此外，这些技术可以很容易地转移到植入鲥鱼或其他敏感物种的无源集成应答器（PIT）标签上，这可以在它们的整个生命史中提供长期监测。

Materials

#11 stainless steel surgical blade	Exel	29502	purchased from Med-Vet International; no real preference on blade vendor
#11 stainless steel surgical blade	Miltex	MIL4-311	purchased from Med-Vet International; no real preference on blade vendor
2 gallon bucket	Leaktite	#2GL White Pail
acoustic transmitter for American shad	Pacific Northest National Laboratory	Patent-Pending	BattelleIPID: 32500
air stone	Pentair	AS3
aquarium air pump	Tetra	Whisper
dissolved oxygen meter	YSI	ProODO or ProSolo
ethanol	Decon Laboratories	2805HC
fine mesh net	Blue Ribbon	ABLEC8
fish holding tank	Reiff Manufacturing	NA	round aquaculture tank
foam garden kneeler	Tommyco	12003
plastic storage container	Ziploc	discontinued; 8oz container with lid
PVC cement	Oatey	30821
PVC pipe	Charlotte Pipe	NA	PVC Schedule 40 2" diameter
PVC primer	Oatey	30757
PVC tee	Charlotte Pipe	NA	2" PVC Schedule 40 S x S x S Tee
sea salt	InstantOcean	SS15-10
silicone tubing 3/16"	Pentair	tp30s	tubing to supply water during tagging
sodium bicarbonate	Fisher Chemical	S233-500
sterile water	NA	NA	water is sterilized using an autoclave
tricaine methanesulfonate	Syndel USA	15650
tubing for airline	Hydromaxx	1403038050