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生物学

인간 유도만능줄기세포(Human Induced Pluripotent Stem Cells)를 중간엽 기질세포(Mesenchymal Stromal Cell)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법의 비교

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/65729
, , , , ,
1National Clinical Research Center for Child Health,The Children’s Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Nephrology,The Children’s Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 3Zhejiang University School of Medicine, 4Liangzhu Laboratory,Zhejiang University

Summary

이 프로토콜은 hiPSC를 중간엽 기질 세포(MSC)로 분화하기 위한 두 가지 대표적인 방법을 설명하고 비교합니다. 단층 방법은 비용이 저렴하고 작동이 간단하며 골형성 분화가 더 쉬운 것이 특징입니다. 배아체(EB) 방법은 시간 소비가 적은 것이 특징입니다.

Abstract

중간엽 기질 세포(MSC)는 재생 의학에서 널리 사용되어 온 성체 만능 줄기세포입니다. 체세포 유래 MSC는 제한된 기증, 품질 변화 및 생물학적 안전성으로 인해 제한됨에 따라 지난 10년 동안 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)에서 MSC를 생성하려는 노력이 크게 증가했습니다. hiPSC를 MSC로 분화하기 위한 과거와 최근의 노력은 (1) 배아체(EB)의 형성과 (2) 단층 배양의 사용이라는 두 가지 배양 방법론을 중심으로 이루어졌습니다. 이 프로토콜은 hiPSC에서 MSC를 유도하는 두 가지 대표적인 방법을 설명합니다. 각 방법은 시간, 비용, 세포 증식 능력, MSC 마커의 발현, 체외 분화 능력 등 장단점을 나타냅니다. 이 프로토콜은 두 방법 모두 hiPSC에서 성숙하고 기능적인 MSC를 도출할 수 있음을 보여줍니다. 단층 방법은 비용이 저렴하고 작동이 간단하며 골형성 분화가 용이한 것이 특징인 반면 EB 방법은 시간 소비가 적은 것이 특징입니다.

Introduction

중간엽 기질 세포(Mesenchymal stromal cell, MSCs)는 중배엽 유래 성체 만능 줄기세포이다1. MSC는 거의 모든 결합 조직에 존재한다2. MSC가 1970년대에 처음 발견되고 1987년 Friedenstein et al.3,4,5에 의해 골수에서 성공적으로 분리된 이래, 다양한 인간 체세포(태아 및 성인 포함) 조직이 뼈, 연골, 힘줄, 근육, 지방 조직 및 조혈 지지 기질과 같은 MSC를 분리하는 데 사용되었습니다 1,2,6,7 . MSC는 많은 체세포 계통으로 분화할 수 있는 높은 증식 능력과 가소성을 보여주며 손상되고 염증이 있는 조직으로 이동할 수 있습니다 2,8,9. 이러한 특성으로 인해 MSC는 재생 의학의 잠재적 후보가 될 수 있다10. 그러나, 체세포 조직 유래 MSC(st-MSCs)는 제한된 기증, 제한된 세포 증식 능력, 품질 변화 및 기증자로부터 병원체의 전염 가능성에 대한 생물학적 안전성 우려에 의해 제한된다11,12.

인간 유도만능줄기세포(Human induced pluripotent stem cell, hiPSCs)는 전사인자(transcription factor)(Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc)로 재프로그래밍하는 성체 세포에서 유래하며, 이는 배아 줄기세포(embryonic stem cell)와 유사한 기능을 갖는다13,14. 그들은 자가 재생이 가능하며 MSC를 포함한 모든 유형의 체세포로 분화할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. st-MSC와 비교하여 iPSC-MSC는 무제한 공급, 저렴한 비용, 더 높은 순도, 품질 관리의 편리성, 규모 생산 및 유전자 변형이 용이하다는 장점이 있습니다 15,16,17.

iPSC-MSC의 이러한 장점으로 인해 iPSC에서 MSC를 구동하는 다양한 방법이 보고되었습니다. 이러한 분화 방법은 두 가지 배양 방법론, 즉 (1) 배아체(EB)의 형성과 (2) 단층 배양(monolayer cultures)의 사용(11,18,19,20)을 중심으로 이루어졌다. 여기에서, 두 가지 방법론 각각에 대한 대표적인 접근법을 특징지었다. 또한, 시간, 비용, 증식 능력, MSC 바이오마커 발현 및 체외 분화 능력에 기반한 두 가지 대표적인 접근법 간의 비교도 이루어졌습니다.

Protocol

1. hiPSC 유지 보수 hiPSC의 해동액체 질소에서 세포를 꺼내고 37°C 수조에서 세포를 빠르게 해동합니다. 해동 셀을 3mL의 iPSC 유지 배지로 준비한 15mL 튜브로 옮깁니다(재료 표). 매체를 부드럽게 섞는다. 300 x g 에서 5분 동안 원심분리기 상층액을 제거하고 10μM Y-27632를 사용하여 1mL의 iPSC 유지 배지에 세포를 부드럽게 재현탁시킵니다(세포를 위아래…

Representative Results

프로토콜(그림 1A)에 따라 hiPSC는 EB 형성 및 단층 배양 방법을 통해 MSC로 분화되었습니다. 분화 과정에서 세포는 서로 다른 대표 형태를 보였습니다(그림 1B,C). 그림 1B에서 볼 수 있듯이 hiPSC 콜로니는 분화 전에 촘촘하게 채워진 세포로 구성된 명확한 경계로 전형적인 조밀한 형태를 나타냅니다. hi…

Discussion

이 프로토콜에서는 hiPSC를 MSC로 분화하는 두 가지 대표적인 방법을 조사하였다 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. 두 방법 모두 hiPSC에서 MSC를 유도할 수 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 과거와 현재의 Mao and Hu Lab의 모든 구성원이 흥미로운 토론과 프로젝트에 큰 기여를 한 것에 대해 매우 감사합니다. 국립아동건강임상연구센터(National Clinical Research Center for Child Health)의 큰 지원에 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립자연과학재단(U20A20351 Jianhua Mao, 82200784 Lidan Hu), 중국 저장성 자연과학재단(No. LQ22C070004 Lidan Hu)에게).

Materials

Alizarin red staining kit Beyotime Biotechnology C0148S
Anti-human-CD105 (PE) Biolegend 323206
Anti-human-CD34 (FITC) Biolegend 343503
Anti-human-CD45 (APC) Biolegend 304011
Anti-human-CD73( APC) Biolegend 344006
Anti-human-CD90 (FITC) Biolegend 328108
Ascorbic acid Solarbio A8100
BMP-6 Novoprotein C012
Carbon dioxide level shaker Crystal CO-06UC6
Compensation Beads BioLegend 424601
CryoStor CS10 STEMCELL Technology 07959
Dexamethasone Beyotime Biotechnology ST1254
DMEM/F12  medium Servicebio G4610
Fetal bovine serum HAKATA HS-FBS-500
FGF2 Stemcell 78003.1
Gelatin Sigma-Aldrich G2500-100G
GlutaMAX Gibco 35050061
human IgG1 isotype control APC BioLegend 403505
human IgG1 isotype control FITC BioLegend 403507
human IgG1 isotype control PE BioLegend 403503
Human TGF-β1 Stemcell 78067
Human TruStain FcX  BioLegend 422301
IBMX Beyotime Biotechnology ST1398
Indomethacin Solarbio SI9020
Insulin Beyotime Biotechnology P3376
iPSC maintenance medium STEMCELL Technology 85850
ITS Media Supplement Beyotime Biotechnology C0341-10mL
Matrigel, growth factor reduced BD Corning 354230
Oli Red O staining kit Beyotime Biotechnology C0158S
Proline Solarbio P0011
Sodium pyruvate ThermoFisher 11360-070
TGFβ3 Novoprotein CJ44
Toluidine blue staining kit Solarbio G2543
TrypLE Express Enzyme(1x)  Gibco 12604013
Ultra-Low Attachment 6 Well Plate Costar 3471
Versene Gibco 15040-66
Y-27632 Stemcell 72304
α-MEM Hyclone SH30265
β-glycerophosphate Solarbio G8100
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References

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Keywords: Induced Pluripotent Stem CellsMesenchymal Stromal CellsDifferentiationEmbryoid BodiesMonolayer CultureRegenerative MedicineDisease ModelingPatient-derived Cells
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Wang, F., Gao, L., Fu, X., Yan, Q., Hu, L., Mao, J. Comparison of Two Representative Methods for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mesenchymal Stromal Cells. J. Vis. Exp. (200), e65729, doi:10.3791/65729 (2023).
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