Seguimiento de la diseminación de células tumorales a partir de metástasis pulmonares mediante fotoconversión
Summary
Presentamos un método para estudiar la rediseminación de células tumorales a partir de metástasis pulmonares que implica un protocolo quirúrgico para la fotoconversión selectiva de metástasis pulmonares, seguido de la identificación de células tumorales rediseminadas en órganos terciarios.
Abstract
La metástasis, la propagación sistémica del cáncer, es la principal causa de muerte relacionada con el cáncer. Aunque comúnmente se piensa que la metástasis es un proceso unidireccional en el que las células del tumor primario se diseminan y siembran metástasis, las células tumorales en metástasis existentes también pueden rediseminarsey dar lugar a nuevas lesiones en sitios terciarios en un proceso conocido como “metástasis a partir de metástasis” o “siembra de metástasis a metástasis”. La siembra de metástasis a metástasis puede aumentar la carga metastásica y disminuir la calidad de vida y la supervivencia del paciente. Por lo tanto, comprender los procesos detrás de este fenómeno es crucial para refinar las estrategias de tratamiento para los pacientes con cáncer metastásico.
Se sabe poco sobre la siembra de metástasis a metástasis, debido en parte a limitaciones logísticas y tecnológicas. Los estudios sobre la siembra de metástasis a metástasis se basan principalmente en métodos de secuenciación, que pueden no ser prácticos para los investigadores que estudian el momento exacto de los eventos de siembra de metástasis a metástasis o qué los promueve o previene. Esto pone de manifiesto la falta de metodologías que faciliten el estudio de la siembra de metástasis a metástasis. Para abordar esto, hemos desarrollado, y describimos aquí, un protocolo quirúrgico murino para la fotoconversión selectiva de metástasis pulmonares, que permite el marcado específico y el seguimiento del destino de las células tumorales que se redistribuyen desde el pulmón a sitios terciarios. Hasta donde sabemos, este es el único método para estudiar la rediseminación de células tumorales y la siembra de metástasis a metástasis de los pulmones que no requiere análisis genómico.
Introduction
La metástasis es la principal causa de muerte relacionada con el cáncer1. El cáncer metastásico surge cuando las células del tumor primario se diseminan por todo el cuerpo y proliferan en tumores clínicamente detectables en órganos distantes 2,3.
Aunque comúnmente se piensa que la metástasis es un proceso unidireccional en el que las células tumorales se diseminan desde el tumor primario y colonizan órganos distantes4, la creciente evidencia clínica y experimental sugiere que está en juego un proceso más complejo y multidireccional. Se ha demostrado que las células tumorales circulantes pueden repoblar el tumor primario (si aún está en su lugar)5,6,7,8,9, y las células tumorales de los focos metastásicos existentes pueden viajar a sitios terciarios y dar lugar a nuevas lesiones 10,11,12,13. De hecho, la evidencia de análisis genómicos recientes sugiere que algunas lesiones metastásicas no surgen del tumor primario, sino de otras metástasis, un fenómeno conocido como “metástasis a partir de metástasis” o “siembra de metástasis a metástasis”14,15,16. La siembra de metástasis a metástasis puede perpetuar el proceso de la enfermedad incluso después de la extirpación del tumor primario, lo que aumenta la carga metastásica y disminuye la calidad de vida y la supervivencia del paciente. Por lo tanto, comprender los procesos que subyacen a la siembra de metástasis a metástasis es crucial para refinar las estrategias de tratamiento de los pacientes con enfermedad metastásica.
A pesar de las implicaciones clínicas potencialmente graves, se sabe poco sobre la siembra de metástasis a metástasis, debido en parte a las limitaciones logísticas y tecnológicas. Los estudios en humanos están limitados por la escasez de muestras clínicas. La resección clínica y la biopsia de lesiones metastásicas son poco frecuentes, al igual que la biopsia de órganos aparentemente sanos, donde pueden estar al acecho células tumorales diseminadas únicas. Esto significa que, por lo general, los estudios en humanos solo son posibles utilizando muestras de autopsias de individuos cuyos tumores primarios todavía están en su lugar o fueron resecados previamente, pero aún están disponibles para los investigadores. Cuando se dispone de estas muestras, se deben realizar análisis de linaje de la progresión del cáncer utilizando métodos de secuenciación14. Sin embargo, la secuenciación masiva de tumores primarios y metástasis compatibles no tiene la sensibilidad necesaria para el rastreo completo del linaje. Por ejemplo, la secuenciación masiva de una lesión puede revelar un subclon que es indetectable en cualquiera de sus lesiones emparejadas. En este caso, no se podría determinar el origen de este subclon. Puede haber estado presente en el tumor primario u otra metástasis con una frecuencia inferior al límite de detección, o puede haber surgido después de la colonización inicial de la lesión metastásica en la que se encontró. La secuenciación de una sola célula proporciona una mayor sensibilidad, pero su alto costo limita la aplicación a gran escala de esta técnica. La naturaleza retrospectiva de estos estudios también significa que proporcionan una visión limitada de los eventos metastásicos transitorios y el panorama de la enfermedad en diferentes momentos.
En modelos animales, los recientes avances tecnológicos permiten ahora un mapeo filogenético prospectivo con alta resolución espacial y temporal 17,18,19,20. Estas técnicas utilizan la edición del genoma CRISPR/Cas9 para diseñar células con un código de barras en evolución, mutaciones heredables que se acumulan con el tiempo. Tras la secuenciación, se puede rastrear el linaje de cada célula en función del perfil mutacional de su código de barras 17,18,19,20. De hecho, esta tecnología ya se está utilizando para mapear la siembra de metástasis a metástasis. En un artículo reciente, Zhang et al. demostraron que las células de cáncer de mama y próstata en metástasis óseas se rediseminan desde el hueso para sembrar metástasis secundarias en múltiples órganos21.
Si bien estos métodos novedosos tienen un gran potencial para generar mapas filogenéticos detallados y de alta resolución de la progresión del cáncer, son muy poco prácticos para aquellos que estudian el momento exacto de los eventos de siembra de metástasis a metástasis y qué los promueve o previene. Llenar estos vacíos de conocimiento es crucial para refinar nuestra comprensión y tratamiento del cáncer metastásico, pero hay una notable falta de tecnologías para facilitar dichos estudios. Para dar respuesta a esta necesidad, recientemente hemos desarrollado -y presentamos aquí- una técnica novedosa que nos permite marcar específicamente las células tumorales mediante fotoconversión en un sitio metastásico (el pulmón) y posteriormente reidentificarlas en órganos terciarios. Utilizando esta técnica, recientemente demostramos que las células de cáncer de mama se rediseminan a partir de metástasis pulmonares y siembran órganos terciarios13. Esta técnica también se puede utilizar para determinar el momento de los eventos de rediseminación dentro de una ventana estrecha y cuantificar las células tumorales redistribuidas, lo que facilita el estudio del organotropismo de las células rediseminadas y lo que promueve/impide la rediseminación.
Si bien la fotoconversión y los sistemas cre/lox localmente inducibles que reemplazan permanentemente una proteína fluorescente por otra se han utilizado previamente para marcar y rastrear las células tumorales 11,22,23, hasta donde sabemos, no se ha optimizado ningún enfoque para el marcado espaciotemporal de las células tumorales para dirigirse al pulmón, uno de los sitios más comunes de metástasis entre hombres y mujeres diagnosticados con cualquiera de los 14 cánceres más comunes24. Cualquier tipo de célula cancerosa y cualquier protocolo para la generación de metástasis pulmonares se pueden utilizar con nuestro procedimiento, lo que lo hace ampliamente útil para los investigadores de metástasis. Todas las células cancerosas utilizadas para generar metástasis pulmonares deben expresar una proteína fotoconvertible o fotoconmutable, y los investigadores pueden elegir qué proteína usar en función de sus necesidades y recursos específicos. En este estudio, utilizamos células de cáncer de mama 6DT1 que expresaban de forma estable la proteína fluorescente fotoconvertible de verde a rojo Dendra2 (células 6DT1-Dendra2)25 marcadas a la histona H2B. Inyectamos 5,0 ×10 4 células 6DT1-Dendra2 en la cuarta almohadilla de grasa mamaria de ratones hembra Rag2-/-. Los tumores primarios fueron palpables entre 12 y 16 días después de la inyección y no se resecaron durante todo el experimento. Las metástasis pulmonares espontáneas se desarrollaron entre 19 y 26 días después de la inyección de células tumorales. Las cirugías de fotoconversión se realizaron entre 26 y 29 días después de la inyección de células tumorales. Los ratones fueron sacrificados a las 72 h postoperatorias debido a la carga de metástasis pulmonar.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este trabajo describimos un protocolo quirúrgico para la fotoconversión selectiva de células tumorales en pulmón. Esta técnica permite a los investigadores marcar selectivamente las células tumorales en el pulmón y rastrear su destino reidentificándolas en todo el cuerpo en un momento posterior, lo que facilita el estudio de la metástasis de las metástasis pulmonares. Utilizando este protocolo, fue posible visualizar células fotoconvertidas en el cerebro, el hígado y el pulmón derecho no fotoconvertido de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Wade Koba por su ayuda con la microtomografía computarizada (S10RR029545), a Vera DesMarais y Hillary Guzik del Centro de Imágenes Analíticas por su capacitación y asistencia con microscopía, al Centro Oncológico Einstein Montefiore, al Instituto Nacional del Cáncer (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), al Centro de Biofotónica Gruss Lipper, al Programa Integrado de Imágenes para la Investigación del Cáncer, una beca postdoctoral Sir Henry Wellcome (221647/Z/20/Z) y un premio METAvivor Career Development Award.
Materials
| 0-30 V, 0-3 A Power Supply | MPJA | 9616 PS | |
| 12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply | MPJA | 17563 PD | |
| 28 G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | |
| 400 nm light emitting diode array lamp | LedEngin Inc. | 897-LZPD0UA00 | Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below) |
| 5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic used in drinking water |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Analgesic |
| Cables (Cable Assemblies) 2.1 DC JACK-STRAIGHT 72" BLACK/ZIP CORD | Mouser | 172-7426-E | |
| Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD | Mouser | 172-0250 | |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Micro Dissecting Scissors |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | Used during mouse intubation |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| High power LEDs – single color ultraviolet 90 watts | Mouser | LZP-D0UA00 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Isoflurane SOL 250 mL PVL | Covetrus | 29405 | Anesthetic |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN | Mouser | 928-C11395TM | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan | CompUSA | #S457-1023 | |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Micro Dissecting Scissors |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory cream |
| Personnet mini retractor | Roboz | RS-6504 | Retractor |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W | Addgene | 51005 | Dendra2 lentivirus |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Black | Mouser | 565-1440-48-0 | |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Red | Mouser | 565-1440-48-2 | |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Wound closing system veterinary kit | Clay Adams | IN015 | Veterinary surgical stapling kit |
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