העברה תת-רשתית של אבות פוטורצפטור שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בעכברי RD10
Summary
אנו מתארים פרוטוקול מפורט להכנת תאי אב קולטי אור שמקורם בתאי גזע עובריים עובריים (photoreceptor) שמקורם בהקפאה, ואת ההעברה התת-רשתית של תאים אלה בעכברי RD10 .
Abstract
רגנרציה של תאים קולטי אור באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים היא טיפול מבטיח לטיפול במחלות רשתית תורשתיות והזדקנות בשלבים מתקדמים. הראינו שמטריצת איזופורם למינין ספציפית לרשתית רקומביננטית אנושית מסוגלת לתמוך בהתמיינות של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לאבות קולטי אור. בנוסף, הזרקה תת-רשתית של תאים אלה הראתה גם שיקום חלקי במודלים של מכרסמים וארנבים rd10 . הזרקה תת-רשתית ידועה כשיטה מבוססת המשמשת להעברת תרכובות פרמצבטיות לתאי קולטני האור ולשכבת אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) של העין בשל קרבתה לחלל המטרה. הוא שימש גם להעברת וקטורים נגיפיים הקשורים באדנו לחלל התת-רשתית לטיפול במחלות רשתית. ההעברה התת-רשתית של תרכובות ותאים פרמצבטיים במודל מורין מאתגרת בשל האילוץ בגודל גלגל העין של מורין. פרוטוקול זה מתאר את ההליך המפורט להכנת תאי אב קולטני אור שמקורם בתאי גזע עובריים עובריים (hESC) להזרקה ואת טכניקת ההעברה התת-רשתית של תאים אלה בעכברי רטיניטיס פיגמנטוזה גנטיים, עכברי RD10 . גישה זו מאפשרת טיפול תאי לאזור הממוקד, במיוחד לשכבה הגרעינית החיצונית של הרשתית, שם מתרחשות מחלות המובילות לניוון קולטני אור.
Introduction
מחלות רשתית תורשתיות וניוון מקולרי הקשור לגיל מובילות לאובדן תאים קולטי אור ובסופו של דבר לעיוורון. הפוטורצפטור ברשתית הוא שכבת המקטע החיצוני של הרשתית המורכבת מתאים מיוחדים האחראים על פוטוטרנסדוקציה (כלומר, המרת אור לאותות עצביים). תאי הפוטורצפטור של המוט והחרוט סמוכים לשכבת הפיגמנטציה ברשתית (RPE)1. טיפול בתחליפי תאים קולטי אור כדי לפצות על אובדן התא היה גישה טיפולית מתפתחת ומתפתחת. תאי גזע עובריים (ESCs)2,3,4, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) שמקורם בתאי RPE, ותאי אב ברשתית (RPCs)4,5,6,7,8 שימשו לשחזור תאי קולטני האור הפגועים. החלל התת-רשתית, חלל מוגבל בין הרשתית ל-RPE, הוא מיקום אטרקטיבי להפקדת תאים אלה כדי להחליף תאים קולטי אור פגומים, RPE ותאי מולר בשל קרבתו 9,10,11.
טיפולים גנטיים ותאיים מנצלים את החלל התת-רשתית לרפואה רגנרטיבית למחלות רשתית שונות במחקרים פרה-קליניים. זה כולל משלוח עותקים פונקציונליים של הגן או כלי עריכת הגנים בצורה של טיפול אוליגונוקלאוטיד אנטי-סנס 12,13 או CRISPR/Cas9 או עריכה בסיסית באמצעות אסטרטגיה מבוססת וירוס הקשור לאדנו (AAV) 14,15,16, השתלת חומרים (למשל, גיליון RPE, תותבות רשתית 17,18,19) ואורגנואידים רשתית ממוינים שמקורם בתאי גזע 20,21,22 לטיפול במחלות רשתית ו- RPE. ניסויים קליניים באמצעות hESC-RPE31 בחלל התת-רשתית לטיפול באמאורוזיס מולד Leber הקשור ל-RPE65 (LCA)23,24, אכרומטופסיה25-מקושרת CNGA3, רטיניטיס פיגמנטוזה26 הקשורה ל-MERTK, כורואידרמיה 27,28,29,30 הוכחו כגישה יעילה. הזרקה ישירה של תאים לקרבת האזור הפגוע משפרת מאוד את הסיכוי להתיישבות תאים באזור המתאים, אינטגרציה סינפטית, ובסופו של דבר שיפור חזותי.
למרות שהזרקה תת-רשתית במודלים אנושיים ובעלי עיניים גדולות (כלומר, חזיר 32,33,34,35, ארנב 36,37,38,39,40 ופרימט לא אנושי 41,42,43) הוקמה, הזרקה כזו במודל מורין עדיין מאתגרת בשל האילוץ של גודל גלגל העין ועצום עדשה הכובשת את עין העכבר 44,45,46. עם זאת, מודלים מהונדסים גנטית זמינים רק בבעלי חיים קטנים ולא בבעלי חיים גדולים (כלומר, ארנבים ופרימטים לא אנושיים), ולכן הזרקה תת-רשתית בעכברים מפנה את תשומת הלב לחקר גישות טיפוליות חדשניות בהפרעות גנטיות ברשתית. שלוש גישות עיקריות משמשות להעברת תאים או AAV לחלל התת-רשתית, כלומר המסלול הטרנס-קרני, המסלול הטרנס-סקלרלי ומסלול הפארס פלנה (ראו איור 2). מסלולים טרנס-קרניים וטרנס-סקלרליים קשורים להיווצרות קטרקט, סינכיה, דימום כורואידי וריפלוקס מאתר ההזרקה 11,44,45,47,48,49. אימצנו את גישת pars plana כהדמיה ישירה של תהליך ההזרקה, וניתן להשיג את אתר ההזרקה בזמן אמת תחת המיקרוסקופ.
לאחרונה תיארנו שיטה שיכולה להתמיין תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) לאבות קולטי אור בתנאים נטולי קסנו, המוגדרים כימית באמצעות איזופורם למינין LN523 ספציפי לרשתית אנושית רקומביננטית. מאחר שנמצא כי LN523 נמצא ברשתית, שיערנו כי ניתן לשחזר את נישת המטריקס החוץ-תאי של הרשתית האנושית במבחנה ובכך לתמוך בהתמיינות קולטני האור מתאי גזע עובריים עובריים36. ניתוח תעתיק חד-תאי הראה כי אבות קולטי אור המבטאים במשותף הומיאובוקס מוט חרוט ומחלימים נוצרו לאחר 32 יום. מודל עכבר מוטנטי של ניוון רשתית 10 (rd10) המחקה רטיניטיס פיגמנטוזה אנושית אוטוזומלית שימש להערכת היעילות של 32 hESC שמקורם באבות פוטורצפטור in-vivo. תאי האב של קולטני האור שמקורם ב-hESC הוזרקו לחלל התת-רשתית של עכברי RD10 ב-P20, שם תפקוד לקוי של קולטני האור והתנוונותו נמשכים36. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט להכנת אבות קולטי אור שמקורם ב- hESC לאחר הקפאה והעברה לחלל התת-רשתית של עכברי rd10 . שיטה זו יכולה לשמש גם למתן AAVs, תרחיפים תאים, פפטידים או כימיקלים לתוך החלל התת-רשתית בעכברים.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההזרקה התת-רשתית שימשה להשתלת תרחיף תאים לטיפול ב-RPE ובמחלות רשתית 23,25,26,27,28,31,40. גישה זו חיונית ביותר במחקרי מכרסמים לא רק עבור השתלות תאים וגישות ריפוי גנטי, אלא ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ל-Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee ו-Yingying Chung על מתן סיוע טכני להכנת 32 אבות קולטני אור שמקורם ב-HESC לאחר שימור בהקפאה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מהמועצה הלאומית למחקר רפואי לחוקר צעיר (NMRC/OFYIRG/0042/2017) ומענק תוכנית המחקר התחרותיתה-24 של הקרן הלאומית למחקר (CRP24-2020-0083) ל-H.G.T.
Materials
| 0.3% Tobramycin | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
| 0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
| 0.5% Proparacaine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
| 1 mL Tuberculin syringe | Turemo | SS01T2713 | |
| 1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
| 2.5% Phenylephrine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
| 24-well tissue culture plate | Costar | 3526 | |
| 30 G Disposable needle | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
| 33 G, 20 mm length blunt needles | Hamilton | 7803-05 | |
| Automated Cell Counter | NanoEnTek | Model: Eve | |
| B27 without Vitamin A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| Buprenorphine | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
| Cyclosporine | Novartis | 260 g/L in drinking water | |
| Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells | DUKE-NUS Medical School | Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36. | |
| Gauze | Winner Industries Co. Ltd. | 1SNW475-4 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Gibco | 11710–035 | |
| hESC cell line H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
| Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µg36 |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
| Microlitre glass syringe (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
| N-2 supplement | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
| NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | With Built-in iOCT function |
| PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA). | |
| Pyruvate | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
| Rd10 mice | Jackson Laboratory | B6.CXB1-Pde6brd10/J mice | Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g |
| Retinoic acid | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
| Round Cover Slip (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
| Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
| Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |
References
- Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
- Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution. Stem Cell Reports. 15 (2), 482-497 (2020).
- Petrus-Reurer, S., et al. Preclinical safety studies of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells for the treatment of age-related macular degeneration. Stem cells translational medicine. 9 (8), 936-953 (2020).
- Wang, S. T., et al. Transplantation of Retinal Progenitor Cells from Optic Cup-Like Structures Differentiated from Human Embryonic Stem Cells In Vitro and In Vivo Generation of Retinal Ganglion-Like Cells. Stem cells and development. 28 (4), 258-267 (2019).
- Wang, Z., et al. Intravitreal Injection of Human Retinal Progenitor Cells for Treatment of Retinal Degeneration. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 26, e921184-e921191 (2020).
- Semo, M., et al. Efficacy and Safety of Human Retinal Progenitor Cells. Translational vision science & technology. 5 (4), 6 (2016).
- Luo, J., et al. Human Retinal Progenitor Cell Transplantation Preserves Vision. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6362 (2014).
- Liu, Y., et al. Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients. Stem cell research & therapy. 8 (1), 209 (2017).
- Maia, M., et al. Effects of indocyanine green injection on the retinal surface and into the subretinal space in rabbits. Retina (Philadelphia, Pa). 24 (1), 80-91 (2004).
- Nickerson, J. M., et al. Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 884, 53 (2012).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal Injection: A Review on the Novel Route of Therapeutic Delivery for Vitreoretinal Diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Murray, S. F., et al. Allele-Specific Inhibition of Rhodopsin With an Antisense Oligonucleotide Slows Photoreceptor Cell Degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6362 (2015).
- Cideciyan, A. V., et al. Mutation-independent rhodopsin gene therapy by knockdown and replacement with a single AAV vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8547-E8556 (2018).
- Maeder, M. L., et al. Development of a gene-editing approach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10. Nature medicine. 25 (2), 229-233 (2019).
- Katrekar, D., et al. In vivo RNA editing of point mutations via RNA-guided adenosine deaminases. Nature methods. 16 (3), 239 (2019).
- Ong, T., Pennesi, M. E., Birch, D. G., Lam, B. L., Tsang, S. H. Adeno-Associated Viral Gene Therapy for Inherited Retinal Disease. Pharmaceutical Research. 36 (2), 34 (2019).
- Pardue, M. T., et al. Neuroprotective effect of subretinal implants in the RCS rat. Investigative ophthalmology & visual science. 46 (2), 674-682 (2005).
- Liu, Z., et al. Surgical Transplantation of Human RPE Stem Cell-Derived RPE Monolayers into Non-Human Primates with Immunosuppression. Stem cell reports. 16 (2), 237-251 (2021).
- Martinez Camarillo, J. C., et al. Development of a Surgical Technique for Subretinal Implants in Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. (190), e64585 (2022).
- Xue, Y., et al. The Prospects for Retinal Organoids in Treatment of Retinal Diseases. Asia-Pacific Journal of Ophthalmology. 11 (4), 314-327 (2022).
- McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
- Lin, B., et al. Retina organoid transplants develop photoreceptors and improve visual function in RCS rats with RPE dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 61 (11), 34 (2020).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet (London, England). 390 (10097), 849-860 (2017).
- Testa, F., et al. Three Year Follow-Up after Unilateral Subretinal Delivery of Adeno-Associated Virus in Patients with Leber Congenital Amaurosis Type 2. Ophthalmology. 120 (6), 1283 (2013).
- Fischer, M. D., et al. Safety and Vision Outcomes of Subretinal Gene Therapy Targeting Cone Photoreceptors in Achromatopsia: A Nonrandomized Controlled Trial. JAMA ophthalmology. 138 (6), 643-651 (2020).
- Ghazi, N. G., et al. Treatment of retinitis pigmentosa due to MERTK mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: results of a phase I trial. Human genetics. 135 (3), 327-343 (2016).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet (London, England). 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Lam, B. L., et al. Choroideremia Gene Therapy Phase 2 Clinical Trial: 24-Month Results. American journal of ophthalmology. 197, 65-73 (2019).
- Xue, K., et al. Beneficial effects on vision in patients undergoing retinal gene therapy for choroideremia. Nature medicine. 24 (10), 1507-1512 (2018).
- Zhai, Y., et al. AAV2-Mediated Gene Therapy for Choroideremia: 5-Year Results and Alternate Anti-sense Oligonucleotide Therapy. American Journal of Ophthalmology. 248, 145-156 (2023).
- Schwartz, S. D., Tan, G., Hosseini, H., Nagiel, A. Subretinal Transplantation of Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelium for the Treatment of Macular Degeneration: An Assessment at 4 Years. Investigative ophthalmology & visual science. 57 (5), ORSFc1-ORSFc9 (2016).
- Vu, Q. A., et al. Structural changes in the retina after implantation of subretinal three-dimensional implants in mini pigs. Frontiers in Neuroscience. 16, 1010445 (2022).
- Spindler, L., et al. Controlled injection pressure prevents damage during subretinal injections in pigs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (9), 5918-5918 (2018).
- Yang, K., et al. Robot-assisted subretinal injection system: development and preliminary verification. BMC Ophthalmology. 22 (1), 1-10 (2022).
- Olufsen, M. E., et al. Controlled Subretinal Injection Pressure Prevents Damage in Pigs. Ophthalmologica. Journal international d’ophtalmologie. International journal of ophthalmology. Zeitschrift fur Augenheilkunde. 245 (3), 285-293 (2022).
- Tay, H. G., et al. Photoreceptor laminin drives differentiation of human pluripotent stem cells to photoreceptor progenitors that partially restore retina function. Molecular therapy the journal of the American Society of Gene Therapy. 31 (3), 825-846 (2023).
- Petrus-Reurer, S., et al. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. Journal of visualized experiments: JoVE. (131), e56702 (2018).
- Petrus-Reurer, S., et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (2), 1314-1322 (2017).
- Babu, V. S., et al. Depleted Hexokinase1 and lack of AMPKα activation favor OXPHOS-dependent energetics in Retinoblastoma tumors. Translational research the journal of laboratory and clinical medicine. (23), 00108-00111 (2023).
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem cell reports. 6 (1), 9-17 (2016).
- Takahashi, K., et al. The influence of subretinal injection pressure on the microstructure of the monkey retina. PLoS ONE. 13 (12), e0209996 (2018).
- Tan, G. S. W., et al. Hints for Gentle Submacular Injection in Non-Human Primates Based on Intraoperative OCT Guidance. Translational Vision Science & Technology. 10 (1), 10-10 (2021).
- Yiu, G., et al. Suprachoroidal and Subretinal Injections of AAV Using Transscleral Microneedles for Retinal Gene Delivery in Nonhuman Primates. Molecular therapy. Methods & clinical development. 16, 179-191 (2020).
- Mühlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized Technique for Subretinal Injections in Mice. Methods in Molecular Biology. 935, 343-349 (2012).
- Huang, P., et al. Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease. Nature Protocols. 17 (6), 1468-1485 (2022).
- Huang, P., et al. The Learning Curve of Murine Subretinal Injection Among Clinically Trained Ophthalmic Surgeons. Translational Vision Science & Technology. 11 (3), 13 (2022).
- Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLOS ONE. 10 (8), e0136523 (2015).
- Irigoyen, C., et al. Subretinal Injection Techniques for Retinal Disease: A Review. Journal of Clinical Medicine. 11 (16), 4717 (2022).
- Parikh, S., et al. An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach. Journal of visualized experiments: JoVE. (118), e54808 (2016).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
