噬菌体（phages）是一类感染细菌的病毒，是肠道微生物组的重要组成部分。尽管这些共生微生物影响着细菌的适应性和种群动态，但其对肠道稳态及疾病的影响机制仍知之甚少。本实验方案采用小鼠模型研究分离的T4噬菌体，该方法可适用于其他噬菌体-细菌组合的研究。
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摘要
摘要
噬菌体（phages）是一类特异性感染细菌的病毒，其宿主范围可精确到物种和菌株水平，是目前已知所有生态系统中数量最丰富的生物实体。在细菌群落（如肠道微生物群）中，噬菌体参与调控微生物群的种群动态，并驱动细菌的进化过程。过去十年间，随着溶菌性噬菌体因其对特定宿主的杀伤能力而展现出对抗日益严峻的抗菌药物耐药性细菌的潜力，噬菌体研究重新受到广泛关注。此外，近期研究表明，噬菌体可黏附于肠黏膜，提示其可能在防止细菌侵入下方上皮组织方面发挥保护作用。尤为重要的是，类似于细菌微生物组，噬菌体组的失衡也已被证实与炎症性肠病等疾病的恶化预后相关。先前的研究已证明，通过粪便滤液移植，噬菌体能够调节动物和人类的微生物组，从而有益于宿主健康。随着这一轮研究热潮的到来，建立并标准化在肠道微生物组背景下研究噬菌体的实验方案变得尤为必要。. 本方案提供了一套用于研究分离的T4噬菌体及其细菌宿主的实验步骤， 大肠杆菌, 在小鼠胃肠道的背景下。本文所述方法概述了 如何从噬菌体裂解液开始，将其施用于小鼠，并评估其对细菌宿主和噬菌体水平的影响。 该方案可经修改后应用于其他噬菌体-细菌组合，为研究宿主-噬菌体相互作用动态提供了起点 体内
引言
噬菌体（bacteriophages，简称phages）是一类能够特异性感染并杀死特定物种和菌株细菌的病毒1。在复杂的细菌群落（如肠道微生物群）中，噬菌体发挥着重要作用，已被证实参与调控细菌种群动态并影响细菌的适应性2。在过去十年中，由于耐药性病原微生物的不断出现3，人们对噬菌体研究重新产生了浓厚兴趣，并开始探索将噬菌体疗法作为替代治疗策略的潜力。近年来，裂解性噬菌体混合制剂已通过静脉注射方式在治疗人类严重的抗生素耐药性细菌败血症感染中取得了一定成效3,4。口服噬菌体疗法也被提出作为治疗肠道感染和炎症的潜在抗生素替代方案。此外，研究表明噬菌体可能在粪便滤液移植（fecal filtrate transplants, FFT）中发挥关键作用；FFT 是经过滤去除细菌后的粪便微生物群制剂，已被用于治疗复发性Clostridioides difficile感染（rCDI）5,6 、炎症性肠病（IBD）7,8以及早产仔猪的....
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方案
所有实验均按照不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会和生物安全委员会批准的方案指南（A23-0113，B19-0038）进行。小鼠饲养于不列颠哥伦比亚大学疾病建模中心的无病原体环境中。C57BL/6小鼠在无菌软膜隔离器内于设施中繁育，并提供无菌小鼠饲料、水、垫料和筑巢材料。小鼠维持在12小时光照/12小时黑暗的循环条件下。实验所用小鼠（包括雄性和雌性）在每项实验中均按年龄匹配，周龄介于6至12周之间，所有实验中小鼠体重为15–30 g。
1. 小鼠口服灌胃用噬菌体及载体裂解液的制备
- 噬菌体纯化与保存液制备
注意：本研究中，T4 噬菌体通过单层琼脂法在细菌菌苔上接种培养并测定滴度，具体方法如下所述。双层琼脂法此前已有报道。25,27 并且同样具有良好的效果。本实验方案选用单层琼脂法，因其可提高噬菌斑的可见度28.- 培养 E. coli 在5 mL无菌LB培养基中，使用无菌聚苯乙烯或玻璃培养管（带盖）。将培养管于 37 °C 以200 rpm振荡培养过夜，直至达到稳定期。
- 在玻璃培养基瓶中，将LB培养基与0.5%琼脂混合，高压灭菌后冷却....
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结果
为研究T4噬菌体与E. coli在小鼠肠道内的相互作用，制备、清洗并纯化了T4噬菌体及对照溶剂裂解液（图1A）。通过噬斑实验测定T4噬菌体裂解液的滴度，并用SM缓冲液稀释至2 × 107 pfu/mL（每只小鼠2 × 106 pfu）。同时对对照溶剂裂解液进行滴度测定以确认无活性噬菌体存在，并用与T4噬菌体裂解液相同体积的SM缓冲液稀释。使用显色法内毒素定量试剂盒测定稀释后裂解液中的内毒素水平。T4噬菌体、热灭活噬菌体及对照溶剂裂解液的内毒素水平均低于饮用水可接受限值（<20 EU/mL）25 （图1B）。由于对照溶剂裂解液的内毒素含量与T4噬菌体裂解液相近，因此被认为适合作为对照。热灭活噬菌体裂解液（热处理前为2 × 107 pfu/mL）的内毒素水平低于对照溶剂和T4噬菌体裂解液。根据试剂盒说明书，对经1-辛醇处理的样品，通过向对照溶剂裂解液中添加内毒素标.......
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讨论
与细菌相比，微生物组中噬菌体的研究面临重大挑战。具体而言，噬菌体缺乏一种所有噬菌体共有的保守系统发育标记，而这种标记在细菌和真核生物中分别由16S和18S核糖体亚基提供，使得原核和真核物种的测序与鉴定得以简便进行。42然而，随着下一代测序技术的进步，包括读长的增加、通量的提高以及成本的降低，噬菌体基因组数据库正在迅速扩展42,43,44。随着噬菌体发现的基础工作不断推进，噬菌体研究如今比以往更加易于开展。作为肠道微生物组的关键成员以及地球上遗传多样性最丰富的生物体，噬菌体为探究微生物组复杂性的新研究提供了极具吸引力的切入点。本文所述的实验方案聚焦于在定植了目标细菌的小鼠中研究已知的噬菌体种类。需要注意的是，这些方案仅为研究噬菌体提供了指导性框架 体内 并可随着该领域的发展而进一步拓展。
随着20世纪40年代抗生素的问世，噬菌体在治疗.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此申明，本研究所进行的区域是 xwməθkwəy̓əm（Musqueam）民族的传统、祖传且未经割让的领地。该土地位于历来为 Musqueam 人民的学习之地，千百年来，他们的文化、历史与传统在此地代代相传。我们鼓励各界人士通过 https://native-land.ca 了解更多有关其生活与工作所在原住民土地的信息。作者感谢来自 Natural 加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）加拿大研究生奖学金-硕士（N.P.），BC省迈克尔·史密斯健康研究会培训生奖（RT-2023-3174，授予MH），加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）发现基金项目（RGPIN-2019-04591，授予C.T.；RGPIN-2016-04282，授予LCO），加拿大先进研究所/人类与微生物组项目（FL-001253 Appt 3362，授予C.T.），迈克尔·史密斯健康研究基金会学者奖（18239，授予C.T.），加拿大卫生研究院（PJT-159458，授予LCO）以及加拿大创新基金会（34673，授予LCO；38277，授予CT）。我们感谢不列颠哥伦比亚大学疾病建模中心（UBC Centre for Disease Modelling）和ubcFLOW提供的技术支持，上述机构由不列颠哥伦比亚大学GREx生物韧性倡议（UBC GREx Biological Resilience Initiative）资助, 并向Osborne实验室和Tropini实验室的成员致以感谢，感谢他们对稿件提出的宝贵讨论与....
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1-辛醇（99%） | 赛默飞世尔科技 | CAAAA15977-AP | |
| 50 ml PES Steriflip 无菌一次性真空滤器单元 | Millipore Sigma | SCGP00525 | |
| 琼脂糖（低电渗/多用途/分子生物学级） | Fisher BioReagents | BP160-500 | |
| Amicon® 100 kDa Ultra-15 离心过滤装置，Ultracel-100 | Millipore Sigma | UFC910008 | |
| BD Microtainer® SST 管 | BD 医疗 | 365967 | |
| 生物排阻气密笼具（ISO笼具） | Techiplast | 1245ISOCAGE | |
| C1000 Touch™ 带有96孔快速反应模块的热循环仪 | BioRad | 1851196 | |
| 二水合氯化钙（白色晶体至粉末） | Fisher BioReagents | BP510-500 | |
| 1.5 mL 离心管盖帽，100 个/包 | 安德温科学公司 | 16812612 | |
| 氯仿（乙醇作为防腐剂/符合美国化学会标准） | Fisher | C298-500 | |
| 铜包钢珠（4.5 mm） | Crosman Corporation | 0767 | |
| DNeasy 血液 & 组织试剂盒（50） | 赛默飞世尔科技 | 69504 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | 赛默飞世尔科技 | K1081 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA）二钠盐溶液，分子生物学用，0.5 M 水溶液 | Sigma Aldrich | E7889 | |
| Fisher BioReagents™ 琼脂，粉末/薄片，Fisher BioReagents™ | Fisher Bioreagents | BP1423-500 | |
| Fisher BioReagents™ 微生物培养基：LB肉汤（粉末）- Lennox | Fisher Bioreagents | BP1427-500 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder | 赛默飞世尔科技 | SM0241 | |
| Green FastMix® qPCR 混合液，1250 次反应 | QuantaBio | 95072-012 | |
| 用于隔离笼盖的高效过滤器，可高压灭菌 H14 级过滤器，适用于 IsoLine - 经辐照处理 | Techiplast | UISOHEPAXTBOX-300 | |
| 七水硫酸镁 | Fisher BioReagents | BP213-1 | |
| MaxQ 6000 恒温摇床 | 赛默飞世尔科技 | 8354-30-0009 | |
| 微生物学培养基：LB 肉汤（粉末）- Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | |
| 带锁定扣盖的微量离心管，2 ml | Fisher | 14-666-315 | |
| Parafilm 密封膜 | 贝米斯 | PM-996 | |
| 噬菌体储备液 | 卡罗来纳生物供应公司 | n/a | |
| PicoLab® 小鼠饮食20 EXT | LabDiet | 5R58 | |
| 皮尔斯™ 显色法内毒素定量试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | A39552S | |
| RNase A（17,500 U） | Qiagen | 19101 | |
| 无RNase的DNase试剂盒 | Qiagen | 79254 | |
| 碳酸氢钠（细白色粉末） | Fisher Chemical | BP328-500 | |
| 氯化钠（结晶/美国化学会认证） | Fisher Chemical | S271 | |
| 超声波破碎仪（探头型号 CL-18；电源型号 FB50） | Fisher Scientific | n/a | |
| 无菌柔性薄膜隔离器 | 生物洁净等级 | n/a | |
| SYBR™ 安全型DNA凝胶染料 | Invitrogen | S33102 | |
| T100热循环仪 | 伯乐（BioRad） | 1861096 | |
| T4噬菌体引物，正向（CCACACATAGCGCGAGTATAA） | IDT | n/a | |
| T4噬菌体引物，正向（GAAACTCGGTCAGGCTATCAA） | IDT | n/a | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| Tris-HCl，1 M 溶液，pH 8.0，分子生物学级，超纯 | 赛默飞世尔科技 | AAJ22638AE | |
| 水（无DNASE、RNASE） | Fisher BioReagents | BP2484100 |
参考文献
- Rohwer, F., Segall, A. M. A century of phage lessons. Nature. 528 (7580), 46-47 (2015).
- Hsu, B. B., et al. Dynamic modulation of the gut microbiota and metabolome by bacteriophages in a mouse model. Cell Host & Microbe. 25 (6), 803-814.e5 (2019).
- Gor....
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