Fare omurilik mikrogliasının hızlı ve verimli bir şekilde zenginleştirilmesi
Summary
Mikroglia, morfolojik ve fonksiyonel adaptasyon yeteneğine sahip, vücuttaki en çok yönlü hücrelerden biri olarak kabul edilir. Heterojenlikleri ve çok işlevlilikleri, beyin homeostazının korunmasını sağlarken, aynı zamanda çeşitli nörolojik patolojilerle de bağlantılıdır. Burada, omurilik mikrogliasını saflaştırmak için bir teknik açıklanmaktadır.
Abstract
Vertebral kolon bir omurgalıyı tanımlar ve omuriliği çevreleyen ve koruyan bir boşluk olan omurilik kanalını şekillendirir. Memeli merkezi sinir sisteminin uygun gelişimi ve işlevi, önemli ölçüde mikroglia olarak bilinen yerleşik makrofajların aktivitesine dayanır. Mikroglia, omurilik ve beyinde farklı gen ekspresyonu ve davranışı sağlayan heterojenlik ve çok işlevlilik gösterir. Çok sayıda çalışma, saflaştırma yöntemlerini kapsamlı bir şekilde detaylandıran serebral mikroglia fonksiyonunu araştırmıştır. Bununla birlikte, farelerde mikroglia’nın omurilikten saflaştırılması kapsamlı bir açıklamadan yoksundur. Buna karşılık, rafine edilmemiş bir ekstraktın aksine, yüksek oranda saflaştırılmış bir kollajenazın kullanılması, merkezi sinir sistemi dokularında raporlamadan yoksundur. Bu çalışmada, 8-10 haftalık C57BL/6 farelerinden vertebral kolon ve omurilik eksize edildi. Sonraki sindirim, yüksek oranda saflaştırılmış bir kollajenaz kullandı ve mikroglia saflaştırması, bir yoğunluk gradyanı kullandı. Hücreler, CD11b ve CD45 boyama yoluyla canlılık ve saflığı değerlendiren akış sitometrisi için boyandı. Sonuçlar ortalama %80 canlılık ve ortalama %95 saflık verdi. Sonuç olarak, fare mikrogliasının manipülasyonu, yüksek oranda saflaştırılmış bir kollajenaz ve ardından bir yoğunluk gradyanı ile sindirimi içeriyordu. Bu yaklaşım, önemli miktarda omurilik mikroglia popülasyonunu etkili bir şekilde üretti.
Introduction
Omurgalıların tanımlayıcı özelliği, notokordun yerini, omurlar arası disklere bölünmüş, omur adı verilen bir dizi parçalı kemik ile değiştirdiği vertebral kolon veya omurgadır. Bu kemik materyalinin art arda gelmesi, omuriliği çevreleyen ve koruyan bir boşluk olan omurilikkanalını şekillendirir 1. Rodentia cinsinde, omurga genellikle yedi servikal omur, on üç torasik omur, altı lomber omur ve değişken sayıda kaudal vertebradanoluşur 2,3. Omuriliğin uzunluğu omurganınkine benzer ve terminal filum, omuriliği sakruma bağlayan sinirsel olmayan bir yapıdır. Ek olarak, sinir lifleri intervertebral foramen1’den çıkar.
Memelilerde merkezi sinir sisteminin gelişimi ve düzgün işlevi, kritik olarak sinir sisteminin mikroglia4 adı verilen yerleşik makrofajlarının aktivitesine bağlıdır. Mikroglia başlangıçta beyinde yerleşik fagositler olarak tanımlansa da, son araştırmalar bu hücrelere birçok dinamik fonksiyon atfetmiştir 5,6. Mikroglia’nın boyutu homeostazda 7 ila 10 μm arasında değişir; Vücuttaki en çok yönlü hücreler arasında kabul edilirler ve sürekli değişen çevrelerine morfolojik ve işlevsel olarak uyum sağlayabilirler7. Bu hücreler hem embriyonik hem de yetişkin aşamalarda yüksek heterojenlik sergilerler8,9, yetişkin aşamasında ise uzay-zamansal bağlamlarına göre karmaşık fonksiyonel heterojenlik sergilerler10. Mikroglia’nın heterojenliği ve çoklu işlevleri, omurilik ve beyinde diferansiyel gen ekspresyonu ve davranışına izin verir. Omurilikte CD11b, CD45, CD86 ve CCR9 ekspresyonunun beyne göre daha yüksek olduğu gösterilmiştir 8,9.
Serebral mikroglia izolasyonu için çoklu protokoller mevcuttur11,12; Bununla birlikte, omurilik mikroglia13,14 için sadece birkaçı mevcuttur. Mikroglia’yı omurilikten arındırmak için bir yöntemin optimize edilmesi, mikroglia fizyolojisini keşfetmeye odaklanan çok sayıda çalışmanın geliştirilmesini kolaylaştırır. Bu protokol, fare omuriliğinin basit ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir ekstraksiyonunu ve mikroglia’nın saflaştırılmasını tanımlamayı amaçlamaktadır (Şekil 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Beyin homeostazındaki önemi nedeniyle mikroglia çalışması için çok sayıda protokol geliştirilmiştir. Bu yöntemlerde, mikroglia tipik olarak embriyonik veya yenidoğan sıçanların ve farelerin serebral hemisferlerindenkaynaklanır 17. Sınırlı sayıda çalışma, yetişkin farelerin omuriliklerinden mikroglia’nın saflaştırılmasını ele almıştır13,14. Bu teknikler, genellikle Percoll veya OptiPrep kullanılarak gradya…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi (CONACYT) (702361) tarafından verilen bursla desteklenmiştir. Yazarlar Ph.D. Ulusal Politeknik Enstitüsü Ulusal Biyolojik Bilimler Okulu’nun Biyolojik Kimya Bilimleri programı.
Materials
| 15 mL collection tubes | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL microtubes | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| 50 mL collection tubes | Corning, USA | 430829 | |
| 70% ethanol | |||
| Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Antibody CD45 PerCP anti-mouse | BioLegend, USA | 103130 | |
| Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Blue Cell Strainer 40 μm | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6-well Clear Not Treated | Corning, USA | CLS3736 | |
| Coverslips | |||
| Digital Heating Shaking Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Dissecting forceps for microsurgery | FT by DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| Electric shaver | |||
| FACS tube | Thermo, USA | 352058 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Flow cytometer Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank’s balanced salt solution | Merck, USA | H2387 | |
| L-glutamine | Corning, USA | 15393631 | |
| Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
| Neubauer chamber Counting Chambers | China | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | density gradient centrifugation |
| Poly-L-lysine solution | Merck, USA | P8920 | |
| Scalpel No. 25 | HERGOM, Mexico | H23 | |
| Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Stereoscopic microscope | Velab, Mexico | HG927831 | |
| Straight surgical scissors (10 cm) | HERGOM, Mexico | ||
| Straight Vannas scissors | HERGOM, Mexico | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Vortex mixer | DLAB, China | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, USA | 423102 | amine-reactive fluorescent dye staining |
References
- Schröder, H., Schröder, , Moser, , Huggenberger, , et al. . Neuroanatomy of the Mouse. , 59-78 (2020).
- Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
- Bab, I., et al. . Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, 205 (2007).
- Nayak, D., et al. Microglia development and function. Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).
- Martinez, F. O., et al. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, 453-461 (2008).
- Masuda, T., et al. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).
- Prinz, M. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
- de Haas, A. H., et al. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
- Xuan, F. L., et al. Differences of microglia in the brain and the spinal cord. Front Cell Neurosci. 13, 504 (2019).
- Paolicelli, R. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
- Li, Q., et al. Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway. Glia. 67 (3), 438-451 (2019).
- Prinz, M., et al. Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation. Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).
- Yip, P. K., et al. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).
- Akhmetzyanova, E. R., et al. Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury. Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).
- Mahadevan, V. Anatomy of the vertebral column. Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).
- Krukowski, K., et al. Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits. Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).
- Cardona, A., et al. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Schmidt, V. M., et al. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk. Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).
