Summary

Estrazione del veleno dalla vespa parassitoide Trichogramma dendrolimi utilizzando un ospite artificiale

Published: October 06, 2023
doi:

Summary

Qui presentiamo un protocollo per l’estrazione del veleno da Trichogramma dendrolimi utilizzando un ospite artificiale creato con film di polietilene e soluzione di amminoacidi.

Abstract

Le vespe parassitoidi sono un gruppo eterogeneo di insetti imenotteri che fungono da risorse inestimabili per il biocontrollo dei parassiti. Per garantire il successo del parassitismo, le vespe parassitoidi iniettano veleno nei loro ospiti per sopprimere l’immunità dei loro ospiti, modulare lo sviluppo, il metabolismo e persino il comportamento degli ospiti. Con oltre 600.000 specie stimate, la diversità delle vespe parassitoidi supera quella di altri animali velenosi, come serpenti, lumache a cono e ragni. Il veleno di vespa parassitoide è una fonte poco esplorata di molecole bioattive con potenziali applicazioni nel controllo dei parassiti e nella medicina. Tuttavia, la raccolta del veleno parassitoide è impegnativa a causa dell’impossibilità di utilizzare la stimolazione diretta o elettrica e della difficoltà di dissezione a causa delle loro piccole dimensioni. Trichogramma è un genere di vespe parassitoidi di minuscole (~0,5 mm) uova ampiamente utilizzate per il controllo biologico dei parassiti lepidotteri sia in agricoltura che nelle foreste. Riportiamo qui un metodo per estrarre il veleno da T. dendrolimi utilizzando ospiti artificiali. Questi ospiti artificiali vengono creati con film di polietilene e soluzioni di amminoacidi e poi inoculati con vespe Trichogramma per il parassitismo. Il veleno è stato successivamente raccolto e concentrato. Questo metodo consente l’estrazione di grandi quantità di veleno di Trichogramma evitando la contaminazione da altri tessuti causata dalla dissezione, un problema comune nei protocolli di dissezione del serbatoio del veleno. Questo approccio innovativo facilita lo studio del veleno di Trichogramma , aprendo la strada a nuove ricerche e potenziali applicazioni.

Introduction

Le vespe parassitoidi sono insetti imenotteri parassiti che rappresentano importanti risorse per la lotta biologica1. Esiste un’ampia varietà di vespe parassitoidi, con oltre 600.000 specie stimate2. La diversità delle vespe parassitoidi supera di gran lunga quella di altri artropodi velenosi, come serpenti, lumache a cono, ragni, scorpioni e api. Il veleno è un importante fattore parassitario nelle vespe parassitoidi. Per il successo del parassitismo, il veleno viene iniettato nell’ospite, modulando il comportamento, l’immunità, lo sviluppo e il metabolismodell’ospite 3. Inoltre, il veleno delle vespe parassitoidi mostra una notevole diversità nelle sue strutture molecolari, nei suoi bersagli e nelle sue funzioni, riflettendo la complessa coevoluzione con i loro ospiti. Pertanto, il veleno parassitoide è una risorsa preziosa e sottovalutata di molecole attive per scopi insetticidi o medici4. A differenza del veleno di serpenti, lumache, ragni, scorpioni e api, il veleno di vespe parassitoidi non può essere raccolto mediante stimolazione diretta o elettrostimolazione5. L’attuale metodo di estrazione del veleno di vespa parassitoide consiste nel sezionare il serbatoio del veleno. Tuttavia, le vespe parassitoidi sono spesso piccole e la dissezione delle vespe parassitoidi richiede elevate competenze tecniche. Pertanto, se riusciamo a trovare un modo per raccogliere il veleno delle vespe parassitoidi in modo efficiente e conveniente, sarà di grande aiuto ricercare il veleno delle vespe parassitoidi.

Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae) è un genere di minuscole vespe parassitoidi (lunghe ~0,5 mm)6. Queste vespe sono tra gli agenti di biocontrollo più utilizzati, in particolare per le uova di vari parassiti lepidotteri sia in agricoltura che nelle foreste. Ad esempio, T. dendrolimi, una delle specie di Trichogramma più utilizzate in Cina, è stata ampiamente applicata per controllare una varietà di parassiti agricoli e forestali, come Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis e Chilo suppressalis. Studi precedenti hanno dimostrato che le vespe Trichogramma potevano iniettare le loro uova in ospiti artificiali7. Gli ospiti artificiali possono essere creati utilizzando materiali come cera8, agar9, Parafilm10 e film plastico11. La soluzione in ospiti artificiali che induce un’ovideposizione sufficiente per Trichogramma può essere semplice, come amminoacidi o sali inorganici12. Sulla base della caratteristica che T. dendrolimi può parassitare gli ospiti artificiali, questo studio fornisce un nuovo metodo per estrarre il veleno dalle vespe parassitoidi utilizzando ospiti artificiali. Questo approccio mira ad affrontare le carenze di bassa resa, bassa purezza e suscettibilità alla contaminazione nelle attuali tecniche di estrazione. Utilizzando questo metodo, è possibile estrarre una grande quantità di veleno ad alta purezza da T. dendrolimi , che soddisfa le esigenze della ricerca scientifica e dello screening di molecole bioattive per scopi insetticidi o medici.

Protocol

1. Allevamento di insetti Somministrare Corcyra cephalonica con farina di mais ad una temperatura di 26 ± 1°C e un’umidità relativa del 40% ± 10%. Allevare il ceppo di T. dendrolimi dell’insetto Jilin indoor utilizzando le uova di Corcyra cephalonica come ospiti. Nutrire gli adulti di vespe con acqua di saccarosio al 10% in provette di Drosophila a una temperatura di 26 ± 1 °C, umidità relativa del 70% ± 10%, luce (L): buio (D) peri…

Representative Results

La concentrazione proteica di campioni di veleno rappresentativi è stata misurata utilizzando il kit di analisi delle proteine, con i risultati presentati nella Tabella 1. I risultati hanno mostrato che la concentrazione di proteine del veleno raccolte con questo metodo variava da 0,35 μg/μL a 0,46 μg/μL, mentre il controllo negativo della soluzione di amminoacidi aveva solo una concentrazione proteica compresa tra 0,03 μg/μL e 0,05 μg/μL. La concentrazione di proteine del veleno raccolte con qu…

Discussion

Qui, presentiamo un metodo per estrarre il veleno da T. dendrolimi utilizzando ospiti artificiali. I punti chiave dell’esperimento di raccolta del veleno sono i seguenti. (1) Durante la preparazione, T. dendrolimi deve essere anestetizzato rapidamente con un’adeguata concentrazione di CO2 . Se la concentrazione di CO2 è troppo bassa, sarà insufficiente per anestetizzare rapidamente il Trichogramma . Al contrario, se la concentrazione è troppo alta, i Trichogramma</e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Riconosciamo il sostegno finanziario della Fondazione per le Scienze Naturali della Provincia di Hainan (Sovvenzione n. 323QN262), della Fondazione Nazionale per le Scienze Naturali della Cina (Sovvenzione n. 31701843 e 32172483), del Fondo per l’Innovazione Scientifica e Tecnologica dell’Agricoltura del Jiangsu (Sovvenzione n. CX(22)3012 e CX(21)3008), la Fondazione “Shuangchuang Doctor” della provincia di Jiangsu (sovvenzione n. 202030472) e il fondo di avvio dell’Università agraria di Nanchino (sovvenzione n. 804018).

Materials

10 μm Nylon Net Millipore NY1002500 For filtering the eggs
10% Polyvinyl alcohol Aladdin P139533 For attractting  T. dendrolimi  to lay eggs
10% Sucrose water Sinopharm Chemical Reagent  10021463 Feed Trichogramma dendrolimi
4x LDS loading buffer Ace Hardware B23010301 SDS-PAGE
Collection box Deli 8555 Container for T. dendrolimi parasitism
Future PAGE  4–12% (12 wells) Ace Hardware J70236502X SDS-PAGE
GenScript eStain L1 protein staining apparatus GenScript L00753 SDS-PAGE
Glass grinding rod   Applygen tb6268 Semicircular protrudations 
L- Leucine Solarbio L0011 Artificial host components
L-Histidine Aladdin A2219458 Artificial host components
L-Phenylalanine Solarbio P0010 Artificial host components
Mini-Centrifuges Scilogex D1008 Centrifuge
MOPS-SDS running buffer Ace Hardware B23021 SDS-PAGE
Omni-Easy Instant BCA protein assay kit Shanghai Yamay Biomedical Technology  ZJ102 For esimation of venom protein concentration
PCR plate layout of 96 holes Thermo Fisher AB1400L Semicircular protrudations 
Polyethylene plastic film Suzhou Aopang Trading   001c5427 Artificial egg card
Prestained color protein marker(10–180 kDa) YiFeiXue Biotech YWB007 SDS-PAGE
Rubber band Guangzhou qianrui biology science and technology 009 Tighten the plastic film and the collection box
Silicone rubber septa mat, 96-well, round hole Sangon Biotech F504416-0001 Semicircular protrudations 

References

  1. Pennacchio, F., Strand, M. R. Evolution of developmental strategies in parasitic hymenoptera. Annual Review of Entomology. 51, 233-258 (2006).
  2. Yan, Z. C., Ye, X. H., Wang, B. B., Fang, Q., Ye, G. Y. Research advances on composition, function and evolution of venom proteins in parasitoid wasps. Chinese Journal of Biological Control. 33 (1), 1-10 (2017).
  3. Asgari, S., Rivers, D. B. Venom proteins from endoparasitoid wasps and their role in host-parasite interactions. Annual Review of Entomology. 56, 313-335 (2011).
  4. Moreau, S. J. M., Guillot, S. Advances and prospects on biosynthesis, structures, and functions of venom proteins from parasitic wasps. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (11), 1209-1223 (2005).
  5. Yan, Z. C., et al. A venom serpin splicing isoform of the endoparasitoid wasp Pteromalus puparum suppresses host prophenoloxidase cascade by forming complexes with host hemolymph proteinases. Journal Biological Chemistry. 292 (3), 1038-1051 (2017).
  6. Woelke, J. B., et al. Description and biology of two new egg parasitoid species (Hymenoptera: Trichogrammatidae) reared from eggs of Heliconiini butterflies (Lepidoptera: Nymphalidae: Heliconiinae) in Panama. Journal of Natural History. 53 (11-12), 639-657 (2019).
  7. Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status, and perspectives. Annual Review of Entomology. 66, 463-484 (2021).
  8. Nettles, W. C. J., Morrison, R. K., Xie, Z. N., Ball, D., Shenkir, C. A., Vinson, S. B. Synergistic action of potassium chloride and magnesium sulfate on parasitoid wasp oviposition. Science. 218, 4568 (1982).
  9. Tilden, R. L., Ferkovich, S. M. Kairomonal stimulation of oviposition into an artificial substrate by the endoparasitoid Microplitis croceipes (Hymenoptera)Braconidae). Annals of the Entomological Society of America. 81 (1), 152-156 (1988).
  10. Xie, Z. N., Li, L., Xie, Y. Q. In vitro culture of Habrobracon hebetor. Chinese Journal of Biological Control. 5 (2), 49-51 (1989).
  11. Han, S. T., Liu, W. H., Li, L. Y., Chen, Q. X., Zeng, B. K. Breeding Trichogramma ostriniae with artificial eggs. Journal of Environmental Entomology. 21 (1), 9-12 (1999).
  12. Li, L. Y., Chen, Q. X., Liu, W. H. Oviposition behavior of twelve species of Trichogramma and its influence on the efficiency of rearing them in vitro. Journal of Environmental Entomology. 11 (1), 31-35 (1989).
  13. Xing, J. Q., Li, L. Y. Rearing of an egg parasite Anastatus japonicus Ashmead in vitro. Acta Entomologica Sinica. 33 (2), 166-173 (1990).
  14. Moreau, S. J. M. "It stings a bit but it cleans well": Venoms of Hymenoptera and their antimicrobial potential. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 186-204 (2013).
  15. Moreau, S. J. M., Asgari, S. Venom proteins from parasitoid wasps and their biological function. Toxins. 7 (7), 2385-2412 (2015).

Play Video

Cite This Article
Wang, H., Yu, Z., Ren, X., Li, Y., Yan, Z. Extracting Venom from the Parasitoid Wasp Trichogramma dendrolimi Using an Artificial Host. J. Vis. Exp. (200), e66032, doi:10.3791/66032 (2023).

View Video