Summary
הפרוטוקול מספק תהליך סטנדרטיזציה מפורט של נוסחת מרתח וטכניקת gavage עם מרתח Yiqi Jiedu במודל העכבר אוסטאוסרקומה כדוגמה. הוא מתאר הגנה על בעלי חיים ומשפר את אמינות נתוני המחקר, ומספק אסטרטגיות יעילות לחקר יעילות טיפולית ומנגנונים מולקולריים של נוסחאות מרתח in vivo.
Abstract
נוסחת מרתח היא צורת המינון הנפוצה ביותר ברפואה הסינית המסורתית ומיושמת בפרקטיקה הקלינית במשך אלפי שנים על ידי מתן דרך הפה, המאופיינת בהשפעה מהירה, ספיגה קלה וטיפול אישי המבוסס על תסמונות ספציפיות של חולים. איכות נוסחת המרתח אחראית ישירות ליעילות הקלינית של הרפואה הסינית המסורתית; לכן, תהליך הסטנדרטיזציה של נוסחת מרתח חשוב כדי למנוע הבדלים באיכות מרתח הנגרמת על ידי גורמים סובייקטיביים. בינתיים, בשל המגבלות של ביצוע ניסויים קליניים, בעלי חיים קטנים הנושאים מחלות אנושיות, כגון עכברים, משמשים לעתים קרובות במחקר רפואי כדי לחקור את היעילות הטיפולית ואת המנגנונים המקיפים של התערבויות שונות, כולל נוסחת מרתח עבור הרפואה הסינית המסורתית. כתוצאה מכך, כשיטת מתן טרנס-אוראלית חשובה, טכניקת ה-gavage המיומנת חשובה במיוחד כדי למנוע נזק פוטנציאלי לוושט ודליפת תרופות, אשר יבטיחו מתן כמות שווה של תרופות לכל חיית מודל, מה שיוביל לתוצאות ניסוי מדויקות. יתר על כן, השיטה הסטנדרטית של הכנת נוסחת מרתח ואסטרטגיית gavage מיומנת נחוצים כדי להגן על רווחת בעלי החיים ולמזער את מספר בעלי החיים בשימוש. כאן, דיווחנו על תהליך סטנדרטיזציה מפורט של נוסחת מרתח וטכניקת gavage עם מרתח Yiqi Jiedu במודל עכבר אוסטאוסרקומה כדוגמה. היעילות הוערכה על ידי נפח הגידול. פרוטוקול זה ימקסם את ההגנה על בעלי חיים וישפר את אמינות נתוני המחקר, ובכך יספק אסטרטגיות יעילות לחקירה עתידית של יעילות טיפולית ומנגנונים מולקולריים של פורמולת מרתח עבור הרפואה הסינית המסורתית in vivo.
Introduction
נוסחת מרתח היא צורת המינון הנפוצה ביותר של הרפואה הסינית המסורתית ותרופות המרפא הנוזליות 1,2. נוסחת המרתח של הרפואה הסינית המסורתית מעובדת על ידי מרתח עשבי תיבול במים לאחר שהושרו, ואחריו סינון כדי להשליך את השאריות.
מכיוון שניתן להתאים אישית את נוסחת מרתח בהתבסס על צרכים קליניים, במיוחד בהתאם למאפיינים של טיפול מבוסס ראיות ברפואה הסינית המסורתית, צורת מינון זו באמצעות מתן דרך הפה מיושמת בפרקטיקה הקלינית במשך אלפי שנים עם יתרונות ספציפיים וחסרי תחליף 3,4. איכות נוסחת מרתח קשורה ישירות ליעילות הקלינית. לכן, נוסחת מרתח חייב להיות מוכן על בסיס העקרונות עבור שיטות מרתח סטנדרטי כדי להבטיח את החומרים הפעילים מופקים באופן מקסימלי מוגן3. בינתיים, תרופות מוכנות מרתח הן הצורה העיקרית של עשבי תיבול סיניים גולמיים המשמשים בפועל קליני; תקני האיכות ושיטות הייצור של תרופות מוכנות מרתח שנקבעו חייבים לעמוד בהוראות הפרמקופיאה הסינית2. יתר על כן, תרופות מרתח מוכן חייב להיות ספוג במי שתייה קרים לפחות 30 דקות לפני להיות decocted בסיר תרופות מיוחד על ידי חימום5. מחקרים הראו כי רוב החומרים הפעילים ניתן לחלץ על ידי decocting במשך פעמיים, ואת הקוד בפועל לניהול חדרי מרתח של תרופות סיניות מסורתיות במוסדות רפואיים גם קובע מרתח להיעשות פעמיים 4,6,7. אם עשבי תיבול סיניים מיוחדים, כגון אחד עם מרקם קשה או טוניקות, נקבעו, זמן מרתח מומלץ להאריך. כלי מרתח ומיכלי אחסון הבאים במגע ישיר עם נוסחת מרתח, החל מן המיכל שבו תרופות מרתח מוכן ספוגים, צריך להיות יציב מבחינה כימית יש מכסים, כגון תבשילי קדרה, קרמיקה, זכוכית נירוסטה. עם זאת, אלומיניום ומוצרי פלסטיק רגילים אין להשתמש, בעוד ברזל וכלים קורוזיביים אחרים יש לאסור כדי למנוע תגובות כימיות אפשריות, אשר יפחיתו את היעילות הטיפולית ואף לייצר השפעות מזיקות 4,6,7.
בשל המגבלות של ביצוע ניסויים קליניים, בעלי חיים קטנים הנושאים את מחלות האדם, כגון עכברים, משמשים לעתים קרובות במחקר רפואי כדי לחקור את היעילות הטיפולית ואת המנגנונים המקיפים של התערבויות שונות, כולל נוסחת מרתח של הרפואה הסינית המסורתית 8,9; עם זאת, בניגוד לבני אדם, נוסחאות מרתח צריך להיות מוכן כל יום, מעורבב יחד, טרי מנוהל 2x ביום בפועל קליני. בעלי חיים אינם מסוגלים לקחת מרצונם את התרופות שלהם בזמן עם המינון הנדרש, ורוב הניסויים בבעלי חיים הקשורים לרפואה הסינית המסורתית הם מתן אוראלי מבוסס gavage של נוסחאות מרתח כיום. נוסחאות המרתח המשמשות לניסויים בבעלי חיים in vivo יש להכין מראש, aliquoted, מאוחסן ב -20 ° C והפשיר ממש לפני השימוש 3,4,10. יתר על כן, אימוביליזציה תת-תקנית של בעלי חיים ומניפולציה של מחטי gavage מגבירים את הסיכון לפציעות מיותרות ולרגשות שליליים. לכן, כשיטה חשובה למתן תרופות דרך הפה, טכניקת ה-gavage המיומנת חשובה במיוחד כדי למנוע פגיעה אפשרית בוושט ושפיכת סמים, ובכך להבטיח שכל חיית מודל תקבל כמות שווה של צמחי מרפא במרשם כדי להשיג תוצאות ניסוי מדויקות. כאן, אנו מספקים פרוטוקול gavage עבור נוסחת מרתח של הרפואה הסינית המסורתית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה מתאר את טכניקת הגבאג' המפורטת בעכברי מודל אוסטאוסרקומה באמצעות מרתח Yiqi Jiedu כדוגמה. עכברים אתימיים זכרים בני ארבעה שבועות (BALB/c nude) שימשו בניסוי זה והוחזקו בחדר הרבייה ברמת SPF של מרכז חיות מעבדה באוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לניהול בעלי חיים והוועדה של אוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית, עמדו בקוד האתי לחיות מעבדה (מספר אישור אתיקה לבעלי חיים: PZSHUTCM2304060007), ונערכו בהתאמה קפדנית לדרישות הבינלאומיות הקשורות לחיות מעבדה.
1. חומרים
- השיגו את החומרים הבאים: צמחי מרפא סיניים (ג'ינסנג 42 גרם, Hedyotis diffusa 52.5 גרם, עשב כיפה 31.5 גרם), מזרק 1 מ"ל ומחט מרפק 12G/55 מ"מ (איור 1).
2. קביעת מינון
- חשב את המינון היומי כדלקמן: המינון היומי למבוגרים עם משקל גוף סטנדרטי של 60 ק"ג הוא ג'ינסנג 12 גרם, Hedyotis diffusa 15 גרם, ועשב כיפה דוקרנית 9 גרם, עם סך של 36 גרם תרופה מוכנה מרתח, כלומר, 0.6 גרם תרופות מוכנות מרתח / ק"ג משקל גוף. בהתייחס 12 פעמים עבור מינון שווה ערך, 6 פעמים עבור מינון נמוך, ו 24 פעמים עבור מינון גבוה בין מבוגרים עם משקל גוף סטנדרטי של 60 ק"ג לבין עכברים עם משקל גוף סטנדרטי של 25 גרם על פי שטח הפנים של הגוף11, כמו גם הנתונים הראשוניים שלנו, להשתמש ביחס מינון 20 פעמים של מרתח Yiqi Jiedu עבור העכברים במחקר הנוכחי, לכן, המינון לעכברים היה 12 גרם תרופות מוכנות למרתח / ק"ג משקל גוף.
- חשב את המינון עבור כל עכבר באמצעות המשוואה:
מינון לעכבר (משקל גוף עמידה) = מינון למבוגר (משקל גוף עמידה) x 20 (יחס מינון שווה ערך ייעודי).
המינון היומי של כל עכבר הוא 0.3 גרם [(12 גרם תרופות מוכנות למרתח / 1000 גרם משקל גוף) x 25 גרם משקל גוף] ב 200 μL עם ריכוז סופי של 1.5 גרם / מ"ל. - חשב את סך התרופות המוכנות למרתח עבור עכברים (n = 7) בקבוצת מרתח Yiqi Jiedu עם ניהול gavage במשך 28 ימים להיות 58.8 גרם. רכז את זה ל 39.2 מ"ל כדי להגיע לריכוז סופי של 1.5 גרם / מ"ל.
- בהתחשב באובדן סמים אפשרי במהלך מרתח ואת שלבי gavage, ולנוחות החישוב, להכין סך של 126 גרם (ג'ינסנג 42 גרם, Hedyotis diffusa 52.5 גרם, עשב כיפה דוקרנית 31.5 גרם) מרתח מוכן תרופה, להתרכז לתוך נפח סופי של 84 מ"ל.
3. מקור התא ותרבית
- רכשו תאי אוסטאוסרקומה 143B שמקורם בבני אדם מבנק תאי ATCC.
- זרע 1 x 106 143B תאים ב 10 מ"ל של מדיום MEM המכיל 10% FBS, 100 U/mL פניצילין, ו 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין בצלחת תרבית תאים 10 ס"מ.
- תרבית תאים 143B ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 עד התאים הם 80%-90% נפגשים.
4. שיטות דוגמנות
- אספו את 80% תאי התרבית 143B בתרבית, הרחיקו מחדש ל-6 מ"ל של 10% מדיום MEM המכיל בסרום וערבבו עם ג'ל מטריצת קרום מרתף ביחס נפח של 1:1 ליצירת תרחיף תאים עם ריכוז סופי של 1 x 107 תאים/מ"ל.
- הזריקו 10 μL של תרחיף התא לתוך השוקה השמאלית של כל עכבר אתימי כדי ליצור מודל עכבר אוסטאוסרקומה באתרו xenograft, כפי שתואר בפרסום הקודם שלנו12. השלבים בקצרה הם כדלקמן.
- שטפו את התאים 2x עם PBS. טריפסיניזציה של התאים עם 1.5 מ"ל של 0.25% טריפסין במשך 3 דקות. יש להוסיף 6 מ"ל של מדיית MEM המכילה 10% בסרום. לאסוף את התאים בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
- יש לשאוף 20 μL של תרחיף תאים לתוך התא של צלחת ספירת התאים ולחשב את ריכוז התא באמצעות מונה תאים אוטומטי. צנטריפוגה את התאים ב 800 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- השליכו את הסופרנאטנט עם פיפטה, השהו מחדש את גלולת התא במטריצת קרום מרתף של 8.5 מ"ג/מ"ל והניחו אותם על קרח.
- מרדימים את העכברים על ידי חשיפתם ל-2% איזופלורן ו-98% חמצן (קצב זרימת חמצן, 2 ליטר/דקה). יש למרוח כמות קטנה של משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
- בצע את כל ההליך באזור מאוורר היטב. לפני הזרקת תאי אוסטאוסרקומה, ודא שכל עכבר נמצא תחת הרדמה עמוקה על ידי נגיעה עדינה ברגל; אם העכבר עדיין כולל תגובות, כגון Twitch או jerk. המתן זמן רב יותר אם העכבר עדיין כולל תגובות, כגון עווית או אידיוט, עד שתגובות אלה ייעלמו.
- הנח את העכבר במצב שכיבה. החזק את קרסול העכבר באמצעות האגודל והאצבע המורה וחטא את אתר ההזרקה של השוקה עם שלושה סיבובים לסירוגין של בטדין ו 70% אתנול ספוגית.
- חברו את המחט למזרק בנפח 1 מ"ל וכוונו את קצה המחט לכיוון מקום ההזרקה המקביל לציר השוקה. החדרה מלעורית של המחט כדי לקדוח חור דרך פלטפורמת השוקה לכיוון הקצה הדיסטלי של השוקה.
- טען את תרחיף תאי האוסטאוסרקומה שהונח בעבר על קרח לתוך מזרק מיקרו-נפח והחלף את מזרק 1 מ"ל בשוקה במזרק מיקרו-נפח טעון תאי אוסטאוסרקומה. הזריקו באיטיות כ-10 מיקרוליטר של (1 x 107 תאים/מ"ל) תרחיף תאי אוסטאוסרקומה לתוך עצם השוקה של כל עכבר אתימי.
- הסר את מזרק microvolume מאתר ההזרקה, ולחץ על אתר ההזרקה עם צמר גפן במשך כ 30 שניות. החזירו את העכבר לכלוב נקי והתבוננו בהחלמתו במשך 10 דקות.
5. הכנת נוסחת מרתח ברפואה סינית מסורתית עבור gavage (איור 2)
- חשב את המינון לפי שלב 2.
- השרו את כל צמחי המרפא למרתח, למעט ג'ינסנג העשב היקר, במי שתייה עם רמה גבוהה ב -3 ס"מ משטח התרופה, למשך 30 דקות, ולאחר מכן בצעו את מרתח 2x כמתואר להלן.
- בצע את מרתח הראשון על ידי חימום רותחים על אש חזקה, ולאחר מכן חימום במשך 15-25 דקות על אש קלה. אש קלה מתייחסת לחום בעוצמה נמוכה עם טמפרטורות הנעות בדרך כלל בין 80 °C (75 °F) ל -100 °C (75 °F), בעוד אש חזקה מתייחסת לחום בעוצמה גבוהה הנע בדרך כלל בין 200 °C (70 °F) ל -300 °C (75 °F).
- יוצקים את נוזל מרתח לתוך מיכל אחד.
- בצע את מרתח השני על ידי חימום צמחי מרפא במי שתייה, עם נפח בדיוק מספיק כדי לטבול את פני התרופה, כדי רותחים על אש חזקה, ולאחר מכן חימום במשך 15-25 דקות על אש קלה.
- יוצקים את נוזל מרתח לתוך אותו מיכל כמו בשלב 5.4.
- להשרות decoct 42 גרם של ג'ינסנג בנפרד, עם מי שתייה 3 ס"מ גבוה יותר משטח התרופה, שכן הוא יקר.
- בצע את מרתח הראשון של ג'ינסנג ספוג על ידי חימום אותו על אש חזקה במשך 60 דקות.
יוצקים את נוזל מרתח לתוך אותו מיכל כמו בשלב 5.4. - בצע את מרתח השני של ג'ינסנג במי שתייה עם נפח בדיוק מספיק כדי לטבול את משטח התרופה, על ידי חימום על אש קלה במשך 40 דקות. יוצקים את נוזל מרתח לתוך אותו מיכל כמו בשלב 5.4.
הערה: המיכלים המשמשים למרתח צריכים להיות יציבים מבחינה כימית, כגון תבשילי קדירה (הנפוצים ביותר בפרקטיקה הקלינית), קרמיקה, זכוכית ונירוסטה כדי למנוע תגובות כימיות אפשריות עם החומרים הרפואיים. כל נוזל מרתח המתקבל משלבים שונים חייב להיות לשים באותו מיכל. - מערבבים ומסננים את נוזל המרתח באמצעות שלוש שכבות של גזה קבועה בפתח מדידה עם גומיות.
- מרתיחים את המרתח המסונן על אש חזקה בסיר, ואז מחליפים לאש קלה ושומרים את האש הקלה עד שמגיעים לריכוז היעד (נפח סופי של 84 מ"ל עם ריכוז סופי של 1.5 גרם/מ"ל).
- הכן 21 מ"ל aliquots של מרתח מרוכז על פי המינון הנדרש לניהול intragastric במשך שבוע אחד, ולאחסן את aliquots במקרר ב -20 מעלות צלזיוס.
6. מתן גאבאג' בעכברים באמצעות מכשיר gavage
- הנח את העכבר על פני כלוב העכבר או משטח מחוספס אחר.
- אחוז בזנב העכבר עם האגודל והאצבע המורה של יד ימין. לאחר מכן, אחוז בצוואר העכבר עם האגודל, האצבע המורה והאצבע האמצעית של יד שמאל.
- החזק את זנב העכבר עם שתי האצבעות האחרות של יד שמאל כדי להפוך את הראש, הצוואר והגוף של העכבר בקו ישר.
הערה: הקפד לשמור על העכבר רגוע במהלך כל תהליך האחיזה. אם העכבר ממשיך להתקשות לנוע, יש לבצע את תהליך האחיזה עד להרפיית העכבר. - החזק את התקן gavage ביד ימין וטען 200 μL של נוסחת מרתח עבור עכבר עם משקל גוף של 20 גרם (נוסחת מרתח 100 μL / 10 גרם משקל גוף של עכבר).
- הכנס את מחט gavage לתוך הפה מהפינה ולדחוף את הלשון כנגד הלסת העליונה של העכבר.
- שמור על גוף העכבר באותו כיוון ודחף בעדינות את מחט gavage לכיוון הבטן לאורך הוושט עד כ 10 מ"מ של מחט gavage נשאר בחוץ.
הערה: יש תחושה חלולה כאשר מחט gavage נכנס לתוך הוושט. יש למדוד את אורך מחט ה-gavage המוחדרת לעכבר עד לחלק העליון של עצם החזה. האורך הכולל של מחט ה-gavage הוא 60 מ"מ (איור 3), ולכן יש להחדיר כ-50 מ"מ של מחט ה-gavage לגוף העכבר לפני הזרקת נוסחת המרתח לקיבתו של עכבר. - להזריק את נוסחת מרתח לתוך הבטן של העכבר. עמידה בהתנגדות או נוזל היוצא מפינת הפה פירושה מיקום שגוי של מחט הגבאג', שיש להימנע ממנה. בנוסף, יש להאט את מהירות ההזרקה אם נוסחת המרתח עבה.
- שחררו את העכבר והתבוננו בהם במשך 10 דקות. הפער מצליח אם לא נצפתה חריגת נשימה ומחזירים את העכבר לכלוב (איור 4).
7. מהלך הטיפול
- כדי לחקור את היעילות הטיפולית של מרתח Yiqi Jiedu, הקימו קבוצת ביקורת וקבוצת מרתח Yiqi Jiedu. עבור עכברים בקבוצת הביקורת, לתת מלוחים פיזיולוגיים, פעם ביום במשך 28 ימים. עבור עכברים בקבוצת מרתח Yiqi Jiedu, לנהל את מרתח Yiqi Jiedu פעם ביום במשך 28 ימים.
8. תגובות שליליות
- שימו לב מקרוב למצב העכברים לאחר שהוחזרו לכלוב, כולל ירידה במשקל וירידה במצב הנפשי עקב חוסר היכולת של מזון להיכנס לקיבה.
- עכברים יחוו קשיי נשימה וקוצר נשימה עקב חסימת קנה הנשימה הנגרמת על ידי מזון וישתעלו בניסיון לנקות את קנה הנשימה. אם אחד מהתסמינים הללו נצפה במהלך gavage, מיד להפסיק את gavage ולהרדים את העכברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההשפעה המעכבת של מרתח Yiqi Jiedu על גדילת אוסטאוסרקומה in vivo נקבעה במודל עכבר תוך טיביאלי xenograft osteosarcoma, שהוכן על ידי הזרקת תאי אוסטאוסרקומה 143B לתוך השוקה של עכברים אתימיים. מרתח Yiqi Jiedu ניתן לעכברים של קבוצת מרתח Yiqi Jiedu על ידי gavage במשך 28 ימים החל מהיום השני של זריקת 143B. מלח פיזיולוגי ניתן לעכברים בקבוצת הביקורת. כל העכברים הומתו לאחר 28 יום. התוצאות הראו כי נפח הגידול בקבוצת מרתח Yiqi Jiedu היה מופחת באופן משמעותי בהשוואה לזה של קבוצת הביקורת (איור 5).
איור 1: חומרים מתכלים למרתח. התרופה המוכנה למרתח מורכבת מ (A) ג'ינסנג, (B) Hedyotis diffusa, (C) עשב כיפה דוקרנית, (D) מדידה מדורגת, (E) גומיות, (F) גזה, (G) תיקון שלוש שכבות של גזה בפתח מדידה עם גומיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הכנת נוסחת מרתח עבור רפואה סינית מסורתית. (A) התרופות המוכנות למרתח, למעט השריית ג'ינסנג למשך 30 דקות. (B) השריית ג'ינסנג בנפרד למשך 30 דקות. (C) השריית ג'ינסנג בנפרד. (D) פורמולת מרתח סינון של הרפואה הסינית המסורתית. (E) אחסון נוסחת מרתח מרוכזת של הרפואה הסינית המסורתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: חומרים מתכלים של Gavage. מזרק רגיל 1 מ"ל עם מחט מקורית (פאנל שמאלי), ומזרק 1 מ"ל עם מחט מקורית מוחלפת על ידי מחט זילוח קיבה מס '12/55 מ"מ לקיבוע מכשיר gavage (פאנל ימני). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: נוהל ניהול gavage בעכבר. (A) עכבר על משטח הכלוב. (B) אחיזה בזנב העכבר ביד אחת. (ג-ד) עכבר להיות קבוע ביד אחת. (E) מחט המוחדרת מפיו של העכבר. (ו) סיום ניהול הגאבאג'. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: השפעה מעכבת של מרתח במודל עכבר אוסטאוסרקומה. (A) דגימות אוסטאוסרקומה שנאספות מקבוצת הביקורת ומקבוצת ההתערבות למרתח Yiqi Jiedu. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן (n=7) (B) בדיקת t לא מזווג של נפח הגידול בין קבוצת הבקרה (Ctrl) לבין קבוצת ההתערבות מרתח Yiqi Jiedu. התערבות מרתח Yiqi Jiedu במשך 28 ימים מעכבת באופן משמעותי את נפח הגידול (p<0.05). קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן (n = 7). (C) משקל הגוף של עכברים בקבוצת המרתח Yiqi Jiedu ובקבוצת הביקורת לאורך תקופת הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היעילות הקלינית של צמחי המרפא שנקבעו ברפואה הסינית המסורתית קשורה במידה רבה למינון ולצורת המינון המנוהלים; לכן, הקמת אסטרטגיית מרתח סטנדרטית ותהליך ניהול מיומן נחוצים בפועל הקליני, כמו גם בשיפור האמינות של תוצאות הניסוי.
במחקר זה, סיפקנו לראשונה אסטרטגיה מפורטת עבור מרתח סטנדרטי של צמחי מרפא סיניים המשמשים בפועל קליני של הרפואה הסינית המסורתית, אשר מקל על ההדרכה של אנשים decoct תרופות מדעית, גם משפר למעשה את איכות נוסחת מרתח ואת היעילות הקלינית של תרופות צמחים; לכן, לאחר השגת התקינה, היא תשפר את הדיוק והעקביות של יעילות רפואת הצמחים בפרקטיקה הקלינית.
אסטרטגיית gavage יושמה באופן נרחב כשיטת צריכה אוראלית במחקרים פרה-קליניים והיא ישימה לבעלי חיים ניסיוניים שונים, כולל עכברים, חולדות וארנבות, המציעה כמה יתרונות, כגון קלות מתן, בקרת מינון מדויקת ויכולת לחקות את המסלול הקליני של מתן תרופות13. עם זאת, בעלי החיים יתקשו אם הם משותקים בתנוחה לא נכונה ללא הרדמה, מה שעלול לאיים על בריאותם של החוקרים ולהפחית את אמינות הניסויים. לכן, הקמת שיטת gavage סטנדרטית חשוב כדי לצמצם את האפשרויות הללו ולמנוע מרתח להיכנס הוושט בטעות או גרימת נזק הוושט, אשר בתורו גורם למוות בעלי חיים וכישלון ניסיוני.
כאן, בחרנו במסלול ה-gavage כדי להעביר את נוסחת המרתח לעכברי מודל אוסטאוסרקומה, מכיוון שהיא אפשרה לנו למדוד במדויק את המינון ולהצדיק אספקת תרופות עקבית לאורך כל הניסוי. כדי להכין את נוסחת מרתח, חישבנו תחילה את כמות התרופות המוכנות למרתח עבור העכבר בהתבסס על יחס של פי 20 מהכמות המשמשת למבוגרים עם משקל גוף של 60 ק"ג; ספוג, ו decocted 2x על ידי חימום לרתיחה; מסנן מרוכז, ומאוחסן מרתח ב aliquots ב -20 °C. כדי לבצע את ניהול gavage, לטעון 200 μL של נוסחת מרתח מרוכז לתוך מכשיר gavage, להכניס את מחט gavage לתוך הפה, בעדינות לדחוף את מחט gavage לכיוון הבטן ולהזריק את נוסחת מרתח לתוך הבטן של העכבר. אחד הממצאים שלנו הוא עיכוב משמעותי של צמיחת הגידול שנצפה בקבוצה שקיבלה את נוסחת המרתח של מרתח Yiqi Jiedu באמצעות gavage. ראינו ירידה ברורה בנפח הגידול בקבוצת מרתח Yiqi Jiedu בהשוואה לקבוצת הביקורת. תוצאות אלה מצביעות על כך שאסטרטגיית gavage מספקת ביעילות את המרכיבים הפעילים של נוסחת המרתח לאתר היעד, וכתוצאה מכך השפעות אנטי-סרטניות חזקות. יתר על כן, הערכנו את פרופיל הבטיחות של אסטרטגיית gavage על ידי ניטור המצב הכללי ומשקל הגוף של העכברים לאורך תקופת הניסוי. לא מצאנו הבדלים משמעותיים בשינויים במשקל הגוף או סימני רעילות בין קבוצת המרתח Yiqi Jiedu לבין קבוצת הביקורת, מה שמצביע על כך שמתן ה-gavage של נוסחת המרתח נסבל היטב ואינו גורם לתופעות לוואי ברורות.
למרות שאסטרטגיית gavage הוכחה כיעילה באספקת נוסחת מרתח לחיות הניסוי, חשוב להבין את תגובות הלוואי הפוטנציאליות ומגבלות מסוימות הקשורות לשיטת ניהול זו. כדי להימנע מחסימת קנה הנשימה הנגרמת על ידי מזון, יש לעקוב מקרוב אחר מצב העכבר במהלך ולאחר ההשתוללות, כגון קשיי נשימה, קוצר נשימה ושיעול. ברגע שכל אחד מהם מופיע, מיד לעצור את gavage ולבצע דחיסות החזה על שולחן עבודה קשיח אופקי; יתר על כן, עזרה וטרינרית מיידית נחוצה לכל מצב חמור. יתר על כן, עלינו לשים לב היטב למגבלות הבאות. ראשית, גבאג' עלול לגרום ללחץ אצל בעלי החיים, מה שעלול להשפיע על הפיזיולוגיה הכללית שלהם ועל התגובה שלהם לטיפול. עם זאת, נקטנו פעולות כדי למזער את הלחץ על ידי שימוש במחט האכלה קטנה וטיפול עדין בעכברים במהלך הליך gavage. יתר על כן, גבאג' יכול להתבצע רק על ידי אדם שהוכשר והוסמך במיוחד כדי להבטיח שימוש בטכניקה סטנדרטית למניעת נזק אפשרי לבעלי החיים14 . שנית, המנגנון המדויק שבו המרכיבים הפעילים של נוסחת מרתח להפעיל את ההשפעות האנטי סרטניות שלהם נשאר לא ברור. ייתכן כי אסטרטגיית gavage עשויה לשנות את הפרמקוקינטיקה והפרמקודינמיקה של תרכובות צמחים, ולהשפיע על זמינותן הביולוגית ויעילותן הטיפולית. מחקרים עתידיים צריכים להתמקד בהבהרת המנגנונים המדויקים העומדים בבסיס ההשפעות האנטי-סרטניות של נוסחת המרתח המועברת באמצעות gavage. יתר על כן, מחקרים דיווחו כי יישום הרדמה איזופלורנית במהלך gavage לטווח ארוך מפחית את בליעה חלקית של מרתח ואת המוות של בעלי חיים עקב טכניקת gavage לא מיומנת15. בינתיים, הוספת שמן בישול למרתח מפחיתה את הלחץ הקשור לבעלי חיים16.
לסיכום, סיפקנו את תהליך המרתח הסטנדרטי של עשבי תיבול סיניים ואת אסטרטגיית gavage מיומנת עבור עכברים. מאמצים אלה לא רק למנוע פציעות ושט אפשריות ומוות של עכברי הניסוי, אלא גם למנוע הצפות תרופות להבטיח כי כל חיה ניסיונית מנהלת כמות שווה של תרופות צמחיות, ולכן, לשפר את הדיוק ואת העקביות של תוצאות הניסוי, גם את ההשפעות הטיפוליות. המחקר שלנו מדגים את היעילות והבטיחות של אסטרטגיית gavage למתן נוסחת מרתח הרפואה הסינית המסורתית במודל עכבר אוסטאוסרקומה. תוצאות אלה מדגישות את הפוטנציאל של שיטת מסירה זו בטיפול באוסטאוסרקומה ומניחות את הבסיס למחקר נוסף באופטימיזציה של אסטרטגיית gavage של מתן הרפואה הסינית המסורתית. בנוסף, מחקרים עתידיים צריכים לחקור את מנגנוני הפעולה המדויקים של המרכיבים הפעילים בנוסחת מרתח ולחקור השפעות סינרגיסטיות פוטנציאליות עם שיטות טיפול אחרות כדי לשפר את התוצאות הטיפוליות בחולי אוסטאוסרקומה. לכן, ממצאים אלה שופכים אור על היתרונות והמגבלות הפוטנציאליים של שיטת מתן זו ומספקים תובנות חשובות לגבי יישומה בטיפול באוסטאוסרקומה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין להם מה לחשוף.
Acknowledgments
העבודה הנוכחית נתמכת על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע (81973877 ו-82174408), (2) תוכנית המו"פ הלאומית של סין (2020YFE0201600), (3) פרויקט הבנייה של מרכז המחקר בעדיפות עליונה בשנגחאי (2022ZZ01009), (4) מרכז החדשנות השיתופית של שנגחאי לשינוי תעשייתי של הכנת TCM בבית החולים, ו-(5) פרויקטי מחקר במסגרת התקציב של אוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית (2021LK047).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
| Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co.,Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | Male | Animal |
| Barbed skullcap herb | Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd. | 20230606 | Decoction-ready medicines |
| Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning BioscienceTechnology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
| Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| Elbow gavage needle (12-gauge/ 55 mm) | RWD Life Science Co., Ltd. | C21014-12 | Component of gastric perfusion device |
| Gauze | Haishi Hainuo Group Co., Ltd. | LC45 | Decoction filter |
| Ginseng | Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Co., Ltd. | 20220704-2 | Decoction-ready medicines |
| Hedyotis diffusa | Shanghai Yanghetang Traditional Chinese Medicine Tablet Co., Ltd. | 2023071107 | Decoction-ready medicines |
| isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
| Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
| Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
| Rubber bands | Shanghai Hengfei Biotechnology Co., Ltd. | XPJ | Fixing gauze on the measuring cup |
| Syringe (1 mL ) | Shanghai Mishawa Medical Industry Co., Ltd. | SBM0040 | Component of gastric perfusion device |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
References
- Gao, S. Discussion on advantages and improvement of traditional Chinese medicine decoction. Chinese Community Physicians (Comprehensive Edition). (21), 12 (2005).
- Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China. , (2015).
- An, Y., et al. Interpretation on specification of traditional Chinese medicine decoction. Herald Med. 42 (11), 1648-1652 (2023).
- Chen, S., et al. Research strategies in standard decoction of medicinal slices. China J Chinese Materia Medica. 41 (8), 1367-1375 (2016).
- Luo, F. Effect of soaking traditional Chinese medicine before decoction on active components. Shanghai Yiyao. 40 (9), 63-64 (2019).
- Liu, F., Chen, M. On the standardization of decocting methods of modern decoction. Global Trad Chinese Med. 7 (5), 377-378 (2014).
- Li, X., et al. Influence of decocting times and instrument on the quality of decoction. J Trad Chinese Med. 50 (6), 550-552 (2009).
- Li, X., et al. Herbal decoctosome is a novel form of medicine. Sci China. Life Sci. 62 (3), 333-348 (2019).
- Lan, Y., Hu, Y., Huang, W., Tang, S. Reflections on PK - PD model based on animal experiments for study of Chinese medicine. Lishizen Med Materia Medica Res. 34 (2), 395-397 (2023).
- Li, Y., Bai, M., Song, Y., Guo, H., Miao, M. Research and reflection on standard decoction of Chinese materia medica. Chinese Trad Herbal Drugs. 49 (17), 3977-3980 (2018).
- Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Estimating the maximum safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers. , https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/estimating-maximum-safe-starting-dose-initial-clinical-trials-therapeutics-adult-healthy-volunteers (2005).
- Chang, J., et al. Intratibial osteosarcoma cell injection to generate orthotopic osteosarcoma and lung metastasis mouse models. J Vis Exp. (176), 63072 (2021).
- He, C.
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Fronti Pedia. 2, 93 (2014).
- Jones, C. P., Boyd, K. L., Wallace, J. M. Evaluation of mice undergoing serial oral gavage while awake or anesthetized. J Am Assoc Lab Animal Sci. 55 (6), 805-810 (2016).
- Recena Aydos, L., et al. Nonalcoholic fatty liver disease induced by high-fat diet in C57bl/6 models. Nutrients. 11 (12), 3067 (2019).
