Summary
Bu protokol, yüksek verimli bir tarama yaklaşımı kullanarak bir floresan boya probu olarak dihidroetidyum (DHE) kullanarak hücre içi reaktif oksijen türlerini (ROS) ölçmek için yeni bir yöntemi açıklar. Protokol, üç farklı hepatoselüler karsinom hücre hattında hücre içi reaktif oksijen türlerinin (ROS) kantitatif değerlendirme yöntemlerini açıklar.
Abstract
Reaktif oksijen türleri (ROS), fizyolojik ve patolojik süreçlerde hücresel metabolizmanın düzenlenmesinde anahtar rol oynar. Fizyolojik ROS üretimi, proliferasyon, sinyalleşme, apoptoz ve yaşlanma gibi normal hücresel fonksiyonların uzamsal ve zamansal modülasyonunda merkezi bir rol oynar. Buna karşılık, kronik ROS aşırı üretimi, diğerlerinin yanı sıra kanser, kardiyovasküler hastalık ve diyabet gibi geniş bir hastalık yelpazesinden sorumludur. ROS seviyelerinin doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçülmesi, normal hücresel işlevselliği anlamak için çok önemlidir. Hücre içi ROS türlerini karakterize etmek için floresan görüntüleme tabanlı yöntemler yaygın bir yaklaşımdır. Literatürdeki görüntüleme ROS protokollerinin çoğunda 2'-7'-diklorodihidrofloresein diasetat (DCFH-DA) boyası kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu boya, kullanımında ve yorumlanabilirliğinde önemli sınırlamalardan muzdariptir. Mevcut protokol, yüksek verimli bir ortamda toplam ROS üretimini ölçmek için alternatif bir yöntem olarak bir dihidroetidyum (DHE) floresan probunun kullanımını göstermektedir. ROS üretimini ölçmek ve ölçmek için yüksek verimli görüntüleme platformu CX7 Cellomics kullanıldı. Bu çalışma üç hepatoselüler kanser hücre hattında (HepG2, JHH4 ve HUH-7) gerçekleştirildi. Bu protokol, DHE çözeltisinin hazırlanması, hücrelerin DHE çözeltisi ile inkübasyonu ve ROS üretimini karakterize etmek için gerekli DHE yoğunluğunun ölçülmesi dahil olmak üzere, hücreler içindeki ROS'un değerlendirilmesinde yer alan çeşitli prosedürlerin derinlemesine bir tanımını sağlar. Bu protokol, DHE floresan boyanın, hücre içi ROS üretimini yüksek verimli bir şekilde karakterize etmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir seçim olduğunu göstermektedir. ROS üretimini ölçmek için yüksek verimli yaklaşımların, toksikoloji, ilaç taraması ve kanser biyolojisi gibi çeşitli çalışmalarda yardımcı olması muhtemeldir.
Introduction
Reaktif oksijen türleri (ROS), hücrelerde normal hücresel metabolizmanın bir parçası olarak oluşan, doğal olarak oluşan, oldukça reaktif ve zamansal olarak kararsız kimyasal radikaller grubudur. ROS,hücrelerde meydana gelen normal fizyolojik ve biyokimyasal süreçlerin modülasyonunda anahtar ve önemli bir rol oynar 1,2. Hücrelerde ROS üretiminin ana kaynağı, normal biyoenerjetik döngünün bir parçası olarak mitokondriyal elektron taşıma zinciri (ETC) yolundandır. ROS üretiminin önemli ek kaynakları, hücrelerdeki hücresel NADPH oksidazlar gibi enzimatik reaksiyonları içerir. Gıda moleküllerinin (örneğin glikoz) metabolizması, mitokondriyal matristeki oksidatif fosforilasyon yolu yoluyla gerçekleşir. Normal fizyolojik hücre sinyalleme süreçlerini düzenlemek için temel düzeyde bir ROS üretimi gereklidir. Glikoz metabolik sinyal yollarının bir parçası olan birçok anahtar protein molekülünün (örneğin, Akt ve PTEN) hücre içi ROS seviyelerine yanıt verdiği bilinmektedir. Ek olarak, ROS, hücresel enzimatik yolların bir parçası olarak ksantin oksidaz, nitrik oksit sentaz ve peroksizomal bileşenler gibi çeşitli hücre içi enzimler tarafından üretilir 1,2. ROS'un doğal kaynaklarının aksine, ksenobiyotikler, bulaşıcı ajanlar, UV ışığı, kirlilik, sigara içimi ve radyasyon gibi bazı çevresel faktörler de hücre içi oksidatif stresin önemli bir itici gücü olan aşırı ROS üretimine yol açar 1,3. Yüksek hücresel oksidatif stres, bir hücre içindeki lipitler, proteinler ve DNA gibi doğal biyomoleküllere zarar vererek kanser, diyabet, kardiyovasküler hastalık, kronik inflamasyon ve nörodejeneratif bozukluklar gibi çeşitli hastalıklara neden olabilir 1,3,4. Bu nedenle, oksidatif strese bağlı hastalık patofizyolojisinde yer alan hücresel mekanizmaları anlamak için ROS'un doğru ölçümleri gereklidir.
ROS üretiminin ve hücrelerin içindeki eliminasyonun kısa zaman çizelgeleri nedeniyle, çeşitli ROS radikallerinin kantitatif ölçümleri bir zorluk olmaya devam etmektedir. Çeşitli hücresel ROS6'yı ölçmek için elektron paramanyetik rezonans (EPR)5, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ve floresan prob tabanlı görüntüleme gibi yöntemler kullanılır. EPR ve HPLC gibi yöntemler nicel olarak doğru tahminler verirken, bu yöntemler hücresel uzamsal morfolojinin yok edilmesini içerir ve genellikle bir numunenin küresel ve toplu ölçümleri şeklindedir. Buna karşılık, floresan probu tabanlı yöntemler gibi görüntüleme tabanlı yöntemler, ROS neslinin hücresel morfolojisini ve uzamsal bağlamını korur. Bununla birlikte, farklı ROS radikalleri için çeşitli floresan problarının özgüllüğü iyi belirlenmemiştir 7,8. Dihidroetidyum (DHE), diklorodihidrofloresein diasetat (DCFH-DA), dihidrorodamin (DHR), dimetil antrasen (DMA), 2,7 diklorodihidroflurescein (DCFH), 1,3-Difenilizobenzofuran (DPBF) ve MitoSox gibi çeşitli floresan problar ticari olarak ROS tespiti için mevcuttur. Geçtiğimiz yıllarda, DHE, MitoSox ve DCFH-DA, hücrelerde ve dokulardaROS'u ölçmek için yaygın olarak kullanılan floresan boyalardır 8,9. DCFH-DA, hücre içiH2O2ve oksidatif stresi tespit etmek için yaygın olarak kullanılan bir boyadır. DCFH-DA'nın popülaritesine rağmen, önceki birçok çalışma, hücre içiH2O2ve diğer ROS seviyelerini 8,9,10,11,12,13,14 ölçmek için güvenilir bir şekilde kullanılamayacağını göstermiştir.
Buna karşılık, floresan prob dihidroetidyum (DHE), hücre içi süperoksit radikaline (O2-) spesifik bir yanıt gösterir. Süperoksit radikali, hücrelerde gözlenen birçok ROS türünden biri olmakla birlikte, diğer hücre içi etkilerin yanı sıra geçiş metallerinin indirgenmesinde, peroksinitrata dönüştürülmesinde ve hidroperoksitlerin oluşumunda rol oynayan önemli bir radikaldir. DHE, hücreler tarafından hızla alınır ve kırmızı dalga boyu aralığında15 floresan emisyonuna sahiptir. Spesifik olarak süperoksit radikali ile reaksiyona girdiğinde, DHE kırmızı bir floresan ürün, 2-hidroksi etidyum (2-OH-E +) oluşturur. Bu nedenle, DHE, süperoksit tespiti için spesifik bir prob olarak düşünülebilir. Bununla birlikte, DHE, ölçülen 2-OH-E + seviyelerine müdahale edebilen ikinci bir floresan ürünü olan etidyum E+ oluşturmak için ONOO- veya OH.,H2O2ve sitokrom c ile spesifik olmayan oksidasyona da uğrayabilir. Bununla birlikte, bu 2-OH E + ve E + ürünleri, kombinasyon halinde, DHE ile boyandığında bir hücre içinde gözlenen toplam hücresel ROS türlerinin büyük bir bölümünü temsil eder. E+ DNA'ya interkalasyon yaparve floresansını büyük ölçüde arttırır 8,9,10,11,13,14,15,16. Etidyum ve 2-hidroksi etidyumun floresan spektrumları sadece biraz farklılık gösterdiğinden, süperoksit üretimine ikincil bir hücrede görülen ROS seviyelerinin çoğu, DHE floresan ürünleri kullanılarak tespit edilebilir ve ölçülebilir. Bu ROS türleri, 480 nm dalga boyu uyarımı ve 610 nm dalga boyu emisyonu 15,16,17 kullanılarak tanımlanır.
Spesifik bir floresan ROS algılama probu seçmeye ek olarak, hücre içi ROS'u ölçmek için hassas bir algılama yöntemi seçmek önemlidir. Bu nedenle, hücre içi ROS seviyelerinin doğru değerlendirilmesi, hastalıklı hücrelerde veya radyasyon, toksikolojik bileşikler ve genotoksik ajanlar gibi çeşitli çevresel stres faktörlerine maruz kalmış hücrelerde meydana gelen bozulmuş redoks dengesi durumlarını belirlemenin anahtarıdır18. ROS, çeşitli hücre sinyal aktivitelerinin düzenlenmesinden sorumlu olan hücrelerde yaygın olarak meydana gelen bir fenomen olduğundan, ROS'un saptanması için sağlam yöntemler gereklidir. Hücreler içindeki ROS üretiminin bu kadar yüksek verimli bir şekilde değerlendirilmesini sağlamak için bu protokol, ROS türlerini ölçmek için yüksek içerikli bir tarama (HCS) platformu kullanır. Mevcut protokol, birçok toksikoloji çalışmasında kritik öneme sahip olan hücre içi ROS üretiminin yüksek verimli analizine izin vermektedir19. Bu protokol, yapışık hepatosellüler karsinom hücrelerinde hücre içi ROS'u saptamak ve ölçmek için kolay ve çok yönlü bir çözüm sağlamayı amaçlamaktadır. H2O2ve menadionun kimyasal reaktifleri, kontrollü ve yüksek verimli bir ortamda ROS üretiminin nispi seviyelerini ölçmek için güçlü ROS stimülatörleri olarak kullanılır. Bu protokol, gerektiğinde uygun koşullar altında yapışık ve yapışık olmayan hücrelerde ROS üretimini ölçmek için ince ayar yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre kültürü
- Test hücrelerini (HepG2, HUH7 ve JHH4 hepatoselüler karsinom hücreleri), kuyu başına 200 μL'lik bir nihai tohumlama hacminde 10.000 hücre / kuyu tohumlama yoğunluğunda 96 oyuklu bir plakaya tohumlayın.
- HepG2 hücrelerini kültürlemeden önce, 96 plaka kuyucuğunu oda sıcaklığında (RT) 2 saat boyunca tip IV kollajen (50 μg / mL) ile kaplayın. Stok kollajenin katılaşmasını önlemek için, stok çözeltisini buza yerleştirin ve ardından istenen konsantrasyona seyreltme işlemini başlatın.
- 2 saatlik bir inkübasyon süresinden sonra, fazla kollajeni aspire edin ve kuyucukları 1x PBS ile üç kez yıkayın.
- Hücreleri, Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyerinde (DMEM) gece boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2 konsantrasyonunda nemlendirilmiş bir inkübatörde yetiştirin.
- Ertesi gün veya% 80-90 birleşmeye ulaştıktan sonra, hangisi daha erken ise, hücreleriH2O2(işlenmemiş, 250 μM, 500 μM, 750 μM ve 1000 μM) ve Menadion (tedavi edilmemiş, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM) ile 30 dakika boyunca temsili oksidatif stresi indüklemek için tedavi edin.
- Alternatif olarak, hücreleri, hücreler içinde oksidatif stresi indükleyebilen istenen test maddesi ile test etmeyi seçin.
2. Hücrelerin DHE boyaması için stok ve seyreltik çözelti hazırlama
- 5 mg DHE'yi 1 mL DMSO içinde çözerek DHE stok çözeltisini (5 mg / mL veya 15.9 mM) hazırlayın.
- DHE stok çözeltisini çift damıtılmış otoklavlanmış su ile son 100 μM konsantrasyonuna seyreltin.
- Boyanın donma ve çözülme sürecini önlemek için (zamanla floresan özelliklerine zarar verebilir), 100 μM konsantrasyonda 1,5 mL santrifüj tüplerinde birkaç alikot hazırlayın ve bunları -20 °C'de saklayın.
- 10 μM'lik bir nihai çalışma konsantrasyonu elde etmek için, 100 μM DHE konsantrasyonunun bir alikotunu kullanın ve önceden ısıtılmış DMEM ortamı ile seyreltin.
NOT: Çalışma solüsyonu deney günü taze olarak hazırlanmalıdır. - Boyanın uygun şekilde karışmasını sağlamak için çalışan floresan boya çözeltisini 5-10 saniye boyunca vorteksleyin.
3. DHE boyama işlemi
- İlaç veya test maddesi içeren ortamı her bir kuyucuktan çıkarın ve 1x PBS veya DMEM ile bir kez nazikçe yıkayın.
NOT: Deneyde ekleme veya yıkama adımlarını gerçekleştirirken, hücreler ve pipetleyici arasında doğrudan temastan kaçınmak çok önemlidir. Bu, hücrelerde olası mekanik hasarı en aza indirmek için PBS'yi kuyucukların kenarları boyunca nazikçe pipetleyerek elde edilebilir. Pipetörün hücrelere doğrudan temas etmemesini sağlamak, deney süresince hücre bütünlüğünün ve canlılığının korunmasına yardımcı olacaktır. - Her bir kuyucuğa 10 μM DHE (çalışma solüsyonu) içeren 100 μL DMEM ortamı ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
- 30 dakikalık inkübasyon süresinden sonra, DHE içeren ortamı çıkarın ve her birini 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez nazikçe yıkayın. Bu, hızlı geri dönüş sağlamak için çok kanallı bir pipetleyici ile gerçekleştirilebilir.
- RT'de 10 dakika boyunca Hoechst 33342 nükleer boyama boyası ile her oyuğa 200 μL 1x PBS ekleyin.
- Hoechst 33342 nükleer boyama solüsyonunu kuyudan çıkarın ve her oyuğa 200 μL 1x PBS ekleyin.
NOT: Sabit hücreler elde etmek için, canlı hücrelerle aynı protokolü izleyin, tedaviden ve DHE boyamadan sonra 5 dakika boyunca% 4 PFA eklemek için ek bir adım atın. PFA solüsyonunu çıkarın ve hücreleri 1x PBS ile yıkayın. Daha sonra, hücreleri nükleer boyama boyası ile 10 dakika inkübe edin. - Mümkün olan en kısa sürede görüntü elde etmek için plakayı yüksek içerikli tarama platformuna, floresan mikroskobuna veya plaka okuyucuya taşıyın.
4. Görüntü toplama ve yoğunluk ölçümü
- Plaka yükleme
- Veri toplama için Cellomics CX7 yüksek içerikli tarama (HCS) yazılımını açın.
- Verilerde puslu veya bulanık görüntülerden kaçınmak için görüntüleme platformunu üreticinin spesifikasyonlarına göre önceden kullanım için tercih edilen özel 96 oyuklu plaka ile dikkatli bir şekilde kalibre edin.
NOT: Çeşitli satıcılardan alınan çok kuyulu plakalar farklı malzeme özelliklerine sahip olabilir ve elde edilen nihai görüntülerin kalitesini etkileyebilir. - Kalibre edildikten sonra, plaka markasına özgü sistem parametrelerini cihaz veritabanına kaydedin ve bunları gelecekteki veri alımları için yeniden kullanın.
- Hazırlanan numunelerin bulunduğu plakayı HCS görüntüleme sisteminin ısıtılmış aşamasına dikkatlice yerleştirin. Plakanın güvenli bir şekilde yerleştirildiğinden ve mikroplaka tutucusunda görüntüleme için doğru yönde olduğundan emin olun (yani, Okuyucu s'de A1 olarak işaretlenmiş etiketi buluntage, ardından mikroplakayı, A1 kuyusunun konumu köşeyle eşleşecek şekilde döndürün.tage çıkartma ile).
- Sahneye düz durduğundan emin olmak için mikroplakaya hafifçe bastırın. HCS sisteminde plakanın eşit olmayan şekilde dengelenmesi, görüntü alımında hatalara neden olabilir.
- Plaka yerine oturduktan sonra, Ctrl tuşunu basılı tutun, ardından yazılımdaki Plaka Yükleme/Boşaltma iletişim kutusunda Ctrl-OK'e tıklayın.
- Görüntüleme parametrelerinin seçilmesi
- HCS görüntüleme sisteminde, Cellomics biyo-uygulamalar arayüzünde Hedef Aktivasyon modunu açın ve (a) nükleer boyama ve (b) DHE floresan probu veri toplama ile uyumlu iki kanallı kurulum protokolünü kullanarak yeni bir protokol oluşturun. Mevcut protokolde, sırasıyla (a) Hoechst 33342 nükleer boyama, (b) toplam ROS üretimi ve (c) süperoksit radikali tespiti için 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS ve 386_BGS_RS filtreler kullanılmıştır. Bu filtrelerin seçimi, bu protokolün bir parçası olarak kullanılan her bir boyanın (DAPI ve DHE) emisyon özellikleri için spesifik örtüşme tarafından yönlendirildi.
NOT: Filtrelerin adlandırma kuralı, örneğin 386-23_BGRFRN_BGRFRN, numunenin 23 nm bant genişliğine sahip 386 nm ışıkla uyarılmasını ve ardından mavi (B), yeşil (G), kırmızı (R), uzak kırmızı (FR) ve yakın kızılötesi (N) ışığı belirli dalga boyu aralıklarında geçiren bir dikroik filtreyi ifade eder ve 386_BGS_RS, dikroikten sonra BGS ve RS emisyon dalga boyu ışığını geçiren bir emisyon filtresini ifade eder. - Gerektiğinde 10x veya 20x büyütme gibi yazılım protokolü arayüzünde görüntü alma işlemi için hedefleri belirtin.
- İstenen görüntüleme detayı seviyesine ve deney için gerekli çözünürlüklere bağlı olarak uygun objektif büyütmeyi seçin. Ancak, her hedefin çözünürlüğü sabittir. Daha yüksek çözünürlük ayrıntısı, platformdaki hedefin değiştirilmesini gerektirecektir. Mevcut protokolde, bu protokolde kullanılan yüksek içerikli tarama platformunun bir parçası olan 20x, 0.45 NA hedefi kullanılmaktadır.
NOT: 20x objektif, görüntüleme çözünürlüğü ayrıntısı ile zaman içindeki ROS değişikliklerini yakalamak için gereken alım hızı arasında iyi bir dengeyi temsil eder. Daha yüksek büyütme hedefleri seçilebilir (örneğin, 40X), ancak bu, çekim sürelerinin artmasına yol açacaktır. - Protokolün özel gereksinimlerine göre pozlama süresi, kamera gruplaması ve z-yığın aralığı gibi görüntü alma kamerasının pozlama ayarlarını belirtin.
NOT: Maruz kalma süresi (genellikle milisaniye cinsinden), kullanılan belirli floroforların sinyal gücüne ve hassasiyetine bağlı olarak değişir. Bu aynı zamanda boya konsantrasyonuna ve boyama kalitesine bağlı olarak deneyden deneye biraz farklılık gösterebilir. Mevcut protokolde, edinme parametreleri şu şekilde sabitlenmiştir - Hedef % -% 35, görüntü alma modu - 1104 x 1104 (2x2 gruplama ile) ve objektif 20x, 0.45 NA. Bu parametreler belirli deney koşullarına göre ayarlanabilir.
- HCS görüntüleme sisteminde, Cellomics biyo-uygulamalar arayüzünde Hedef Aktivasyon modunu açın ve (a) nükleer boyama ve (b) DHE floresan probu veri toplama ile uyumlu iki kanallı kurulum protokolünü kullanarak yeni bir protokol oluşturun. Mevcut protokolde, sırasıyla (a) Hoechst 33342 nükleer boyama, (b) toplam ROS üretimi ve (c) süperoksit radikali tespiti için 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS ve 386_BGS_RS filtreler kullanılmıştır. Bu filtrelerin seçimi, bu protokolün bir parçası olarak kullanılan her bir boyanın (DAPI ve DHE) emisyon özellikleri için spesifik örtüşme tarafından yönlendirildi.
- Görüntüleme yapılandırma parametreleri
NOT: Görüntüleme parametreleri ayarlandıktan sonra, yazılım arayüzü kullanılarak görüntü toplama işlemi başlatılabilir.- Görüntü toplama parametreleri
- Cihazda bulunan farklı algoritmaları (optik - izoveri, sabit ve üçgen) kullanarak ilgilenilen birincil izleme nesnesini (hücrelerin çekirdeği) tanımlayın.
NOT: Bu protokolde birincil nesnenin tanımlanması ve işaretlenmesi için izoveri yöntemi kullanılır. - Nesneyi (varsa) şekil veya yoğunluk parametresine göre bölümlere ayırın.
- Birincil nesneyi, her hücre türüne özgü istenen boyut, şekil ve yoğunluk parametrelerine göre doğrulayın.
- Ardından, bu birincil nesnenin etrafındaki 'ilgi alanını' (ROI) tanımlayın.
NOT: ROI, floresan boyanın yoğunluğunun hücre tipleri arasında tutarlı ve tekrarlanabilir olarak tanımlandığı konumu tanımlayan önemli bir veri toplama parametresidir. ROI, cihazın farklı kanallarındaki her bir birincil izleme nesnesi (yani bir hücre) için ölçülen temel parametreleri (boyanın yoğunluğu gibi) tanımlar. ROI, her hücrenin çekirdeğinin etrafında bir daire veya halka şeklinde tanımlanabilir. HCS yazılımı, otomatik bir şekilde bölümlere ayrılan ve analiz edilen her hücre için ROI limiti dahilinde kanal 2'deki DHE floresan boya işaretleyicisinin yoğunluğunu otomatik olarak elde eder. - Birincil nesnenin (çekirdek) etrafına 20 μm'lik bir daire yerleştirin. Bu çalışmada 20 μm'lik mesafe, bu protokolde kullanılan çeşitli hücre hatlarının (HepG2, JHH-4 ve HUH-7) yaklaşık boyutlarına göre seçilmiştir. Hücrelerin etrafındaki 20 μm'lik halka ROI, floresan yoğunluğunu tutarlı ve tekrarlanabilir bir şekilde elde etti.
NOT: Bir ROI seçiminde anahtar parametre, hücre alanını yeterince kapsama yeteneğidir; döngüsel ROI'nin boyutu hücre boyutuna bağlıdır. Daha büyük hücreler daha büyük bir yatırım getirisi gerektirebilir ve daha küçük bir yatırım getirisi için bunun tersi de geçerlidir. Bu parametreler, ilgilenilen her hücre tipi ve floresan boya için önceden belirlenmelidir.
- Cihazda bulunan farklı algoritmaları (optik - izoveri, sabit ve üçgen) kullanarak ilgilenilen birincil izleme nesnesini (hücrelerin çekirdeği) tanımlayın.
- Görüntü toplama parametreleri
- Popülasyon karakterizasyonu ve depolanacak özellikleri seçme
- HCS görüntüleme protokolünde çeşitli toplama parametreleri tanımlandıktan sonra, HCS sistemini veri toplama moduna ayarlayın.
- Bu protokol için görüntü elde etme parametreleri şu şekilde ayarlandı: alan başına minimum 10 nesne (hücre) gereksinimi ile 1000 hücre/kuyu tarama sınırı.
NOT: Her bir kuyucuk için değerlendirilen alan sayısı, 1000 sayısına ulaşan nihai hücre sayısına göre belirlenmiştir. HCS sistemi, 1000 hücre/kuyu hedef popülasyonunu elde edene kadar kuyu içinde çeşitli yerleri aramaya devam eder. Bu nedenle edinme hızı, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğunda bulunan birleşmeye ve toplam hücre sayılarına bağlıdır. Mevcut protokolde, kanal 2'nin toplam ve ortalama yoğunluğu (süperoksit radikallerini ve toplam ROS üretimini temsil eder) daha sonraki aşağı akış analizleri için her bir kuyudan toplanmıştır.
- Görüntü yakalama, işleme ve analiz
- Görüntü elde etme parametrelerini ayarladıktan ve sonlandırdıktan sonra, her 96 oyuklu plaka için tarama işlemini başlatın.
NOT: Cellomics CX7 görüntüleme sistemi, hücreler içinde ROS üretimi de dahil olmak üzere çeşitli parametrelerin numunelerinin yüksek içerikli taranmasını ve otomatik analizini sağlar. ROS üretimine ek olarak, HCS sistemi, hücre morfolojisi, hücre altı lokalizasyonu ve ilgilenilen diğer birçok hücresel özellik gibi çeşitli parametreler hakkında ek değerli bilgiler sağlayabilir. Elde edilmek üzere optimize edildikten sonra, HCS görüntüleme platformu, hücre parametrelerinin sağlam bir şekilde kapsamlı, kalitatif ve kantitatif karakterizasyonuna olanak tanır. - Tarama işlemi tamamlandıktan sonra, View Analysis yazılımını başlatın ve ek analiz için çeşitli nicel veri parametrelerini .csv bir formatta dışa aktarın.
- Üçüncü taraf yazılımları kullanarak, ek aşağı akış analizleri için ilgilenilen çeşitli nicel değerleri kopyalayıp yapıştırın.
NOT: Mevcut protokolde,H2O2ve menadion maruziyetlerine bağlı indüklenmiş oksidatif strese yanıt olarak DHE yoğunluk değerlerini analiz etmek için GraphPad Prism yazılımı kullanılmıştır.
- Görüntü elde etme parametrelerini ayarladıktan ve sonlandırdıktan sonra, her 96 oyuklu plaka için tarama işlemini başlatın.
- Veri ve istatistiksel analiz
- Kanal 2'nin ortalama ortalama yoğunluğunu hesaplayın (toplam ROS değerlerini ve süperoksit radikallerini temsil eder).
NOT: Yoğunluk değerlerini hesaplamak için yapılan tüm deneyler, her doz seviyesinde koşul başına 6 kopya ile üç kez tekrarlandı. - Çeşitli test koşulları arasındaki yoğunluk değerlerindeki farklılıkları ölçmek için tek yönlü ANOVA veya t-testi gerçekleştirin.
- Kanal 2'nin ortalama ortalama yoğunluğunu hesaplayın (toplam ROS değerlerini ve süperoksit radikallerini temsil eder).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dihidroetidyum (DHE), hücre içi ROS durumları hakkında spesifik bilgi sağlayan süperokside duyarlı bir floresan boyadır. DHE boyası, sitoplazmada doğal olarak mavi floresan yayar. Bununla birlikte, süperoksit radikalleri ile etkileşime girdiğinde, kırmızı dalga boylarında (>550 nm) floresan yayan 2-hidroksietidiyuma dönüştürülür (Şekil 1). DHE boyası hücrelere ve çekirdeğe kolayca taşınır. Yayılan floresan, birçok laboratuvarda yaygın olarak bulunan bir floresan mikroskobu kurulumu ile görselleştirilebilir. Bu çalışmada, DHE boyasının çoklu hepatoselüler karsinom hücre hatları - HUH7, JHH4 ve HepG2 hücreleri üzerinde ROS tür üretiminin bir probu olarak kullanımı, yüksek içerikli bir tarama platformunda test edildi. Hücreler, hücrelerde oksidatif stresi indüklemek için 30 dakika boyunca (a) hidrojen peroksit ve (b) menadion olmak üzere iki ROS üreten ajan - (a) hidrojen peroksit ve (b) menadion ile muamele edildi (dozlama ayrıntıları için bkz. Şekil 2 ve Şekil 3) ardından 96 oyuklu bir plakada DHE boya etiketlemesi. HemH2O2hem de menadion, her üç hücre hattında da floresan yoğunluğunu doza bağlı bir şekilde önemli ölçüde arttırdı. Yüksek verimli tarama platformundaki görüntü segmentasyonu ve niceleme algoritmaları kullanılarak, ROS kaynaklı DHE floresansının yoğunluğu, altı kopya boyunca kuyu başına 1000 hücrede ölçüldü. Üç bağımsız kopya ölçüldü ve sonuçlar toplandı ve analiz edildi. Hoechst 33342 nükleer boyası, her bir oyukta yapışık hücrelerin bulunduğu düzlemin belirlenmesinde önemli bir rol oynar. Ek olarak, 2-OH-E+ ve E+ floresansı, yüksek verimli tarama platformunda sırasıyla test edilen hücrelerin hem çekirdeğinde hem de sitoplazmasında tespit edilebilir (bkz. Şekil 4).
H2O2'ye maruz kalma, doza bağlı bir şekilde analiz edilen tüm hücre hatlarında ROS kaynaklı floresansın istatistiksel olarak anlamlı bir artışına neden olmuştur (bkz. Şekil 2; alt panel). Bununla birlikte, menadion maruziyeti durumunda böyle bir doza bağlı yanıt görülmemiştir. Menadion ile, JHH4 hücre hattı floresan yoğunluğunda doza bağlı bir artış gösterirken, HepG2 ve HUH7 hücre hatlarında, floresan yoğunluğunda önemli bir fark sadece daha yüksek menadion konsantrasyonlarında gözlenmiştir (bkz. Şekil 3; alt panel). ROS üretim yanıtlarındaki bu farklılıklar,H2O2ve menadionun ROS üretiminin farklı mekanizmalarından kaynaklanıyor olabilir. H2O2, hücrelerde ROS oluşumunu daha doğrudan bir şekilde tetiklerken (örneğin, peroksidazlar ve katalazlar gibi antioksidan enzimlerin etkisiyle), menadionun, indüklenmiş mitokondriyal disfonksiyon yoluyla dolaylı bir şekilde ROS türleri ürettiği varsayılmaktadır. ROS üretiminin dolaylı mekanizması nedeniyle, DHE floresansının menadion ile ortaya çıkması için daha fazla zaman gerekebilir. Bu bulgular, ROS'a bağımlı DHE floresansının oksidatif strese maruz kalma süresine, konsantrasyonuna ve hücre tiplerine duyarlı olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, her benzersiz hücre tipi için deneysel protokolün optimizasyonu bir zorunluluktur. Daha da önemlisi, bu protokol, DHE boyasının toksikoloji, kanser biyolojisi ve ilaç taraması gibi alanlarda kullanılan yüksek verimli bir şekilde ROS tespit ajanı olarak kullanılmasının fizibilitesini göstermektedir.
Şekil 1: DHE floresan molekülünün sırasıyla 2-hidroksietidyum (2-OH-E +) ve etidyuma (E +) oksidatif dönüşüm yollarını gösteren bir şema. 2-OH-E+ ve E+'nın floresan emisyon spektrumları, 480 nm'lik bir uyarımda örtüşür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hidrojen peroksit tedavisi, hücre içi ROS seviyelerini doza bağlı bir şekilde arttırır. Hepatosellüler karsinom hücreleri - (A) HUH7, (B) JHH4 ve (C) HepG2, 30 dakikalık bir süre boyunca 250 μM, 500 μM, 750 μM ve 1000 μM dozlarındaH2O2ile tedavi edildi. Hücreler, 30 dakika daha kültür ortamında DHE (10 μM) boya ile boyandı, ardından Hoechst 33342 nükleer boyama yapıldı. Her kuyucukta toplam 1000 hücre sayıldı. DHE floresansında doğrusal, doza bağlı bir artış, her üç hücre hattında da gözlenir (üst panel). 500 μM ve üzeri dozlama için tüm hücre hatlarında floresanda istatistiksel olarak anlamlı artışlar görülür (alt panel). Her veri seti, üç bağımsız deneyden elde edilen 96 oyuklu bir plakada ortalama altı kopyadır (n = 3). Tedavi koşulları, tek yönlü ANOVA testi kullanılarak tedavi edilmemiş örneklerle karşılaştırıldı (**** - p < 0.0001, *** - p < 0.001; görüntü ölçek çubuğu - 50 μm) Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Menadion tedavisi, hücre içi ROS düzeylerini doza bağlı bir şekilde arttırır. Hepatoselüler karsinom hücreleri - (A) HUH7, (B) JHH4 ve (C) HepG2, 30 dakikalık bir süre boyunca 25 μM, 50 μM, 75 μM ve 100 μM dozlarında menadion ile tedavi edildi. Hücreler, 30 dakika daha kültür ortamında DHE (10 μM) boya ile boyandı, ardından Hoechst 33342 nükleer boyama yapıldı. Her kuyucukta toplam 1000 hücre sayıldı. DHE floresansında doğrusal, doza bağlı bir artış, her üç hücre hattında da gözlenir (üst panel). Maksimum doz (100 μM; alt panel) için floresanda istatistiksel olarak anlamlı artışlar tutarlı bir şekilde görülür. Farklı hücre hatlarında (JHH4 > HUH7 > HepG2) kalan menadion dozları için değişkenlik gözlenir. Her veri seti, üç bağımsız deneyden elde edilen 96 oyuklu bir plakada ortalama altı kopyadır (n = 3). Tedavi koşulları, tek yönlü ANOVA testi kullanılarak tedavi edilmemiş örneklerle karşılaştırıldı (**** - p < 0.0001, *** - p < 0.001; görüntü ölçek çubuğu - 50 μm) Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Tek hücreli DHE floresansı - 30 dakikalık bir süre boyunca (A) hidrojen peroksit ve (B) menadion ile tedaviden sonra gözlenen DHE floresan değişikliklerinin yakından görünümü. Farklı hücrelerde DHE floresansının sitoplazmik ve nükleer değişiklikleri gözlenir. Yüksek içerikli tarama platformu tarafından oluşturulan otomatik segmentasyon maskesi de görülüyor. Görüntü ölçek çubuğu - 10 μm. Büyütme - 20x. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Hidrojen peroksite yanıt olarak süperoksit kaynaklı DHE floresansının görüntülenmesi. Hepatosellüler karsinom hücreleri - (A) HUH7, (B) JHH4 ve (C) HepG2, 30 dakikalık bir süre boyunca 250 μM, 500 μM, 750 μM ve 1000 μM dozlarındaH2O2ile tedavi edildi. Hücreler daha sonra 30 dakika daha kültür ortamında DHE (10 μM) boya ile boyandı. Daha sonra, hücreler 386 nm LED ile aydınlatıldı ve >560 nm'de toplanan floresan görüntüleme yapıldı. Spektral çapraz konuşmayı önlemek için nükleer karşı boyama yapılmadı. 500 μM'> dozlarda DHE floresansında doza bağlı bir artış gözlenir. UV aydınlatmalı DHE floresansının süperoksit radikal üretiminin çoğundan kaynaklanması beklenmektedir. Her veri seti, iki bağımsız deneyden elde edilen 96 oyuklu bir plakada ortalama altı kopyadır (n = 2). Tedavi koşulları, tek yönlü ANOVA kullanılarak işlem görmemiş örneklerle karşılaştırıldı (**** - p < 0.0001, *** - p < 0.001; görüntü ölçek çubuğu - 50 μm) Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: Menadione'a yanıt olarak süperoksit kaynaklı DHE floresansının görüntülenmesi - Hepatoselüler karsinom hücreleri - (A) HUH7, (B) JHH4 ve (C) HepG2, 30 dakikalık bir süre boyunca 25 μM, 50 μM, 75 μM ve 100 μM dozlarında menadion ile tedavi edildi. Hücreler daha sonra 30 dakika daha kültür ortamında DHE (10 μM) boya ile boyandı. Hidrojen peroksite benzer şekilde, DHE floresansında doza bağlı bir artış gözlenmiştir. Her veri seti, iki bağımsız deneyden elde edilen 96 oyuklu bir plakada ortalama altı kopyadır (n = 2). Tedavi koşulları, tek yönlü ANOVA kullanılarak işlem görmemiş örneklerle karşılaştırıldı (**** - p < 0.0001, *** - p < 0.001; görüntü ölçek çubuğu - 50 μm) Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, yüksek içerikli bir tarama sistemi üzerinde dihidroetidyum (DHE) floresan boyası kullanılarak süperoksit kaynaklı hücre içi reaktif oksijen türleri (ROS) üretimini değerlendirmek için bir protokol oluşturulmuştur. Literatürde mevcut olan mevcut protokollerin çoğu, ROS türlerini ölçmek için bir floresan görüntüleme probu olarak DCFH-DA'yı kullanır. Bununla birlikte, çok sayıda çalışma, DCFH-DA'nın hücre içi ROS ölçümü için ideal bir prob olmadığını göstermiştir. DCFH-DA'nın bir prob olarak uygun olmaması için öne sürülen çeşitli nedenler şunları içerir: (i) DCFH-DA, H2O2 ile doğrudan bir reaksiyon göstermez, bu da onu hücre içiH2O2seviyesini değerlendirmek için uygun olmayan bir boya yapar. (ii) OH.,NO2. ve ONOO- gibi birkaç tek elektronlu oksitleyici tür, DCFH'yi DCF'ye oksitler. (iii) geçiş metalleri, sitokrom c ve hem peroksidaz, oksijen veH2O2varlığında DCFH oksidasyonunu teşvik edebilir. (iv) En önemlisi, DCFH-DA, oksijen varlığında ek süperoksit üretimini indükleyen ara ürün DCFH.- / DCF.'yi üretir. O2 ile dismutasyon.- ek H2O2 üretir, bu da floresan yoğunluğunun artefakt bir artışına ve hatalı olarak yüksek ROS seviyelerine neden olabilir. Birden fazla yazar, DCFH-DA'nın hücre içiH2O2ve diğer ROS türlerinin tespiti için güvenilmez bir floresan probu olarak kullanıldığını düşünmüştür 8,9,10,11,12,13,14.
DCFH-DA'nın aksine, DHE, spesifik olarak süperoksit radikali ile reaksiyona girerek bir floresan ürünün, 2-hidroksietidyumun (2-OH E +) üretilmesine yol açar. Süperoksit olmayan ROS türleri, ikinci bir floresan ürün olan etidyum (E +) üretmek için DHE ile reaksiyona girebilir. 2-OH-E+ ve E+'nın floresan spektrumları nispeten benzer olsa da, bu iki molekül hücre içi ROS türleri ve DHE arasındaki spesifik etkileşimlerin son ürünlerini temsil eder ve oksidatif stres nedeniyle hücrelerde gözlenen toplam floresan yoğunluğundan sorumludur. Bazı çalışmalar, daha kısa UV aralığı dalga boylarında (<400 nm) seçici uyarımın, 2-OH etidyum uyarımı (E + 'nın aksine) ve dolayısıyla süperoksit radikal üretimi için daha spesifik olabileceğini göstermiştir 7,12,14. Bu, hücrelerin yalnızca 386 nm LED ışıkla heyecanlandırılmasıyla değerlendirildi. 480 nm dalga boyu uyarımına göre, 560 nm dalga boyunda azaltılmış bir emisyon yoğunluğu gözlenmiştir (bkz. Ek Şekil 1 ve Ek Şekil 2). Bununla birlikte, bunun yalnızca 2-OH Etidyum floresansından kaynaklandığından ve mevcut yaklaşımın potansiyel bir eksikliğini temsil ettiğinden emin olunamaz. Diğer çalışmalar, UV uyarımının (örneğin, 386 nm), 2-OH etidyum 7,15'e kıyasla daha düşük seviyelerde de olsa eşzamanlı etidyum floresan emisyonuna neden olabileceğini göstermiştir. Ne olursa olsun, protokolümüz, yüksek içerikli bir görüntüleme ve tarama sistemi kullanarak hücre içi ROS üretiminin çoğunluğunun kantitatif farklılıklarını ölçmek için DHE'yi daha iyi bir boya alternatifi olarak belirler.
ROS üretiminin ara sürücülerinin eksikliğinin (DCFH-DA'da görülenler gibi), hücre içi ROS üretimini değerlendirmek için DHE kullanımında önemli bir avantaj olduğu varsayılmaktadır. Bununla birlikte, DHE floresansının bu mekanizması henüz kesin olarak kurulmamıştır. ROS seviyelerinin doğru bir şekilde ölçülmesinin gerekli olduğu durumlarda, hücrelerdeki 2-OH-E + seviyelerini doğru bir şekilde tahmin etmek için HPLC ve / veya sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi (LC-MS) yöntemleri gibi ek ortogonal nicel doğrulama yöntemlerinin kullanılması tavsiye edilir 8,9,13. Bununla birlikte, HPLC ve LC-MS yöntemlerinin mutlaka değerlendirme için hücrelerin toplanmasını ve çözündürülmesini içerdiğinin farkında olunmalıdır. Bu nedenle, mevcut protokolde olduğu gibi floresan tabanlı bir görüntüleme yönteminde kodlanan uzay-zamansal bilgi, HPLC ve LC-MS'de kaybolacaktır ve görüntüleme tabanlı ROS değerlendirme yöntemlerinin önemli bir avantajını temsil etmektedir. DHE'nin kırmızıya kaymış floresansının ek bir avantajı, kırmızı ışığın taşıdığı daha düşük enerji nedeniyle daha uzun dalga boylu ışığın (kırmızı renkte) hücreler için daha az toksik olmasıdır.
Göreceli hücre içi ROS değişikliklerini ölçmek için DHE floresansının doza bağımlı doğası, oksidatif stres indükleyicileri olarak menadion ve hidrojen peroksit kullanılarak test edildi. Menadion ve hidrojen peroksit, ROS ve oksidatif stres oluşumunun değişken mekanizmaları nedeniyle test maddeleri olarak seçilmiştir20,21. Menadion maruziyetine bağlı ROS üretimi dolaylı iken (mitokondriyal disfonksiyon yoluyla),H2O2daha doğrudan bir şekilde oksidatif stres üretir. Artan menadion konsantrasyonları, doğrusal, tekrarlanabilir ve doza bağlı bir şekilde DHE floresan üretiminin artmasına yol açtı. Menadione'ye benzer şekilde,H2O2, Fenton kimyası yoluyla doğrudan hidroksil radikalleri (OH) üretebilen iyi bilinen bir ROS indükleyicisidir22. H2O2maruziyetine bağlı olarak DHE floresansında benzer şekilde doğrusal ve doza bağlı bir yanıt gözlenmiştir. DHE'nin spesifik olarak süperoksit radikali için seçiciliği nedeniyle,H2O2ile doğrudan reaksiyona girmez. Bunun yerine, üretilen hücre içi süperoksit radikalleri başlangıçtaH2O2ile reaksiyona girerek Haber-Weiss ve Fenton reaksiyonları yoluyla hidroksi radikalleri gibi ikincil ROS türleri oluşturur ve bunlar daha sonra DHE floresansı23 ile tespit edilir. DHE'nin floresan emisyon spektrumu, hücre içi ROS üretiminin çoğunluğunu ölçerek iki farklı oksitleyici maddeye yanıt olarak mevcut protokoldekurulmuştur 8,13. Bu sonuçlar, yüksek verimli tarama yaklaşımları kullanılarak hücre içi ROS seviyelerinin tespiti ve miktarının belirlenmesi için daha iyi bir alternatif olarak floresan DHE boyasının faydasını ortaya koymaktadır.
DHE'nin üstün seçiciliği, hassasiyeti ve optik özellikleri, mevcut protokolde belirtildiği gibi, ROS üretimini ve oksidatif hasarı yüksek verimli bir şekilde araştırmak için değerli bir alternatif haline getirmektedir. Laboratuvarımızdaki gelecekteki çalışmalar, yüksek verimli bir ortamda çeşitli fizyolojik ve patolojik koşullar altında ROS ve hücresel sinyal mekanizmaları arasındaki çapraz reaktivitede bir ROS belirteci olarak DHE'nin rolünü araştıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
RK ve RRG, UNM Biyoloji ve Tıpta Metaller Merkezi'nden (CMBM) NIH NIGMS hibesi P20 GM130422 aracılığıyla bir hibe ile desteklenmiştir. RRG, NM-INSPIRES P30 hibesi 1P30ES032755'ten bir pilot ödülle desteklendi. CX7 Cellomics cihazı için görüntüleme çekirdeği desteği, NIH hibe P20GM121176 tarafından finanse edilen AIM merkez çekirdekleri aracılığıyla sağlandı. CX7 Cellomics görüntüleme platformunun kullanımıyla ilgili teknik konulardaki paha biçilmez yardımları için Dr. Sharina Desai ve Dr. Li Chen'e teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | VWR | 20170-038 | |
| 96- well plate | Corning Costar | 07-200-90 | |
| Cellomics Cx7 | ThermoFisher | HCSDCX7LEDPRO | |
| Collagen | Advanced Biomatrix | 5056 | |
| DHE (Dihydroethidium) | ThermoFisher | D1168 | |
| DMEM | Sigma | 6046 | |
| FBS | VWR | 97068-085 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.0 | |
| HepG2 cell line | ATCC | ||
| Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
| HUH7 cell line | ATCC | ||
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 88597 | |
| JHH4 cell line | ATCC | ||
| Menadione | Sigma | M5625 |
References
- Juan, C. A., et al. The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies. Int J Mol Sci. 22 (9), 4642 (2021).
- Magnani, F., et al. Structure and mechanisms of ROS generation by NADPH oxidases. Curr Opin Struct Biol. 59, 91-97 (2019).
- Collin, F. Chemical basis of reactive oxygen species reactivity and involvement in neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 20 (10), 2407 (2019).
- Uttara, B., et al. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Curr Neuropharmacol. 7 (1), 65-74 (2009).
- Dikalov, S. I., et al. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).
- Wang, Q., et al. Measurement of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial ROS in AMPK knockout mice blood vessels. Methods Mol Biol. 1732, 507-517 (2018).
- Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
- Gomes, A., et al. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Halliwell, B., et al. Free radicals in biology and medicine. , Oxford University Press, Oxford Academic. USA. (2015).
- Cho, S., et al. Fluorescence-based detection and quantification of features of cellular senescence. Methods Cell Biol. 103, 149-188 (2011).
- Dikalov, S. I., et al. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxid Redox Signal. 20 (2), 372-382 (2014).
- Kalyanaraman, B., et al. Recent developments in detection of superoxide radical anion and hydrogen peroxide: Opportunities, challenges, and implications in redox signaling. Arch Biochem Biophys. 617, 38-47 (2017).
- Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (41), 15038-15043 (2006).
- Zielonka, J., et al. Detection of 2-hydroxyethidium in cellular systems: a unique marker product of superoxide and hydroethidine. Nat Protoc. 3 (1), 8-21 (2008).
- Nazarewicz, R. R., et al. Rapid and specific measurements of superoxide using fluorescence spectroscopy. J Biomol Screen. 18 (4), 498-503 (2013).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
- Ameziane-El-Hassani, R., et al. Detection of reactive oxygen species in cells undergoing oncogene-induced senescence. Oncogene-Induced Senescence: Methods Protoc. 1534, 139-145 (2017).
- Abraham,, et al. High content screening applied to large-scale cell biology. Trends Biotechnol. 22 (1), 15-22 (2004).
- Criddle, D. N., et al. Menadione-induced reactive oxygen species generation via redox cycling promotes apoptosis of murine pancreatic acinar cells. J Biol Chem. 281 (52), 40485-40492 (2006).
- Goffart, S., et al. The type and source of reactive oxygen species influences the outcome of oxidative stress in cultured cells. Cells. 10 (5), 1075 (2021).
- Kurutas, E. B. The importance of antioxidants which play the role in cellular response against oxidative/nitrosative stress: current state. Nutr J. 15 (1), 71 (2015).
- Shad, K. F., Das, T. K. Introductory Chapter: Role of Fenton and Haber-Weiss Reaction in Epilepsy. Epilepsy-Seizures without Triggers. IntechOpen. , (2023).
