RNA干扰（RNAi）技术在许多体型微小的寄生性天敌昆虫中的应用面临巨大挑战，例如 赤眼蜂属 黄蜂。本研究阐明了一种高效的RNAi方法 赤眼蜂（Trichogramma dendrolimi）. 本方法为研究基因调控提供了一个可靠的模型 赤眼蜂属 黄蜂
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摘要
摘要
卵寄生蜂Trichogramma spp. 被公认为在农业和林业中防治多种鳞翅目害虫的有效生物防治剂。Trichogramma 后代的幼体阶段在寄主卵内发育，体型极为微小（成虫体长约0.5 mm）。RNA干扰（RNAi）技术已成为阐明多种生物基因功能的关键工具。然而，在某些小型寄生蜂（如Trichogramma）中实施RNAi操作通常面临重大挑战。本研究提出了一种在Trichogramma dendrolimi中高效实施RNAi的方法。该方案包括从寄主卵中获取并分离单个T. dendrolimi个体、设计与合成双链RNA（dsRNA）、体外移植与培养T. dendrolimi蛹、显微注射dsRNA，以及通过RT-qPCR分析评估靶基因的敲低效果。本研究提供了一套完整且图文详尽的T. dendrolimi RNAi实验操作流程，使研究人员能够深入探究该物种的基因调控机制。此外，该方法经少量调整后亦可适用于其他Trichogramma物种的RNAi研究或显微注射实验，因此可为开展其他内寄生性物种的RNAi实验提供重要参考。
引言
Trichogramma 属是一类卵寄生蜂，在全球范围内的农业和森林生态系统中被广泛用作高效生物防治剂，以防控多种鳞翅目害虫1,2,3,4。大规模人工繁殖的Trichogramma 的应用为害虫的可持续治理提供了一种环境友好型策略5,6,7。通过研究基因调控和基因组编辑方法10，深入了解Trichogramma 蜂的分子生物学特性，可为提高这些生物防治剂的大规模繁殖效率和田间表现提供重要依据8,9。
自从发现双链RNA（dsRNA）介导的特异性基因干扰以来 秀丽隐杆线虫 自1998年以来，RNA干扰（RNAi）技术已发展成为一种重要的遗传学工具，通过抑制目的基因的表达来研究生物体的调控机制
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方案
注意：有关本实验方案中使用的所有材料、仪器、软件和试剂的详细信息，请参见材料表。
1. 昆虫培养物的收集与保育
- 使用体积比为1:5的阿拉伯胶粉末水溶液，将约5,000粒谷螟卵（Corcyra cephalonica (Stainton)）粘附于一张9 cm × 16 cm的卡片上25,26。
注意：避免在卡片上粘附过多寄主卵，过度密集会妨碍后续的转移和解剖操作。 - 为防止寄主卵孵化，将寄主卵卡片置于紫外光（UV）下照射30分钟（图1-i）。随后，将含有灭活卵的纸张裁剪成直径8 cm、厚1 cm的卵卡，每张卵卡包含约300–500粒卵（图1-ii）25,26,27。
- 将80–120头T. denrolimi蜂引入一根....
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结果
T. denrolimi 蛹在注射 dsFerhch 后的羽化率显著低于注射 dsGFP 或未注射个体（表1）。在成功羽化的蜂中，51.85% 接受 dsFerhch 处理的 T. denrolimi 出现翅发育畸形、翅变小的现象。而在注射 dsGFP 或未注射的蜂中未观察到畸形个体（表1）。此外，注射 dsFerhch 的 T. denrolimi 蛹腹部出现黑色素沉积，这是铁代谢异常的表型特征23。而在注射 dsGFP 或未注射的 T. denrolimi 蛹中未观察到黑色素沉积现象（图4）。
RT-qPCR 分析显示，在注射 dsFerhch 24 小时后，T. denrolimi 蛹中 <.......
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讨论
Trichogramma 蜂类被公认为有效的生物防治制剂，专门针对农业和林业中多种鳞翅目害虫1。这些微小的蜂类在其寄主卵内完成未成熟阶段的发育，这一特性为开展RNAi实验带来了挑战5,18。本研究提供了在 T. denrolimi 中进行RNAi实验的全面可视化指南。鉴于 Trichogramma 属内各物种具有相似的生物学特性，该方法经适当调整后可轻松适用于其他 Trichogramma 物种以及内寄生性蜂类的RNAi研究或显微注射实验。
该方案引入了多种创新方法，可实现高效的dsRNA显微注射，并简化RT-qPCR流程 T. denrolimi以及优化移植和 体外 孵育 T. denrolimi 蛹。根据本研究，移植蛹的羽化率达到90%，且无需任何注射。当移植蛹接受ds处理时GFP<.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本研究由国家自然科学基金项目（32172476，32102275）、农业科技创新计划（CAAS-ZDRW202203，CAAS-ZDRW202108）以及中央引导地方科技发展资金（XZ202301YD0042C）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2x ES Taq MasterMix（含染料） | Cowin Biotech, 中国 | CW0690H | 用于扩增dsRNA序列 |
| 20x PBS缓冲液，DEPC处理（pH 7.2–7.6） | Sangon Biotech, 中国 | B540627-0500 | 用于稀释dsRNA |
| 琼脂条 | 石狮环球琼脂工业有限公司，中国 | n/a | 用于制备培养基 |
| 氨苄青霉素钠 | Sangon Biotech, 中国 | A610028 | 用于制备培养基 |
| Bioer恒温金属浴 | BIOER, 中国 | MB-102 | 用于合成dsRNA |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | WPI, 美国 | 1B100-4 | 用于拉制毛细玻璃针 |
| 超净工作台 | Airtech, 中国 | SW-CJ-1FD | 用于提取RNA |
| 双蒸水 | Sangon Biotech, 中国 | A500197-0500 | 用于稀释cDNA |
| 环境测试培养箱 | Panasonic, 日本 | MLR-352H-PC | 用于培养T. denrolimi |
| Eppendorf离心机 | Eppendorf, 德国 | 5418R | 用于储存RNA样品 |
| Eppendorf FemtoJet 4i | Eppendorf, 德国 | FemtoJet 4i | 用于向T. denrolimi注射 |
| Eppendorf制冷离心机 | Eppendorf, 德国 | 5810R | 离心 |
| 乙醇溶液（75%，RNase-free） | Aladdin, 中国 | M052131-500ml | 用于提取RNA |
| 凝胶回收试剂盒 | Omega, 美国 | D25000-02 | 用于提取cDNA |
| 阿拉伯胶 | Solarbio, 中国 | CG5991-500g | 用于制作卵卡 |
| 异丙醇 | Aladdin, 中国 | 80109218 | 用于提取RNA |
| 激光毛细管拉制仪 | SUTTER, 美国 | P-2000 | 用于拉制毛细玻璃针 |
| 微量加样器 | Eppendorf, 德国 | 20 µL | 用于加载dsRNA |
| 多样品组织研磨仪 | LICHEN, 中国 | LC-TG-24 | 用于研磨T. denrolimi |
| 针头研磨仪 | SUTTER, 美国 | BV-10-E | 用于研磨毛细玻璃针 |
| 无核酸酶水 | Sangon Biotech, 中国 | 用于稀释RNA | |
| OLYMPUS显微镜 | OLYMPUS, 日本 | XZX16 | 用于观察T. denrolimi |
| PCR仪 | Bio-rad, 美国 | S-1000 | 用于DNA扩增 |
| PowerPac Basic | Bio-rad, 美国 | PowerPacTM Basic | 用于检测dsRNA质量 |
| dsGFP引物（正向） | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA | ||
| dsGFP引物（反向） | [TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG | ||
| FerhchqPCR引物（正向） | TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT | ||
| FerhchqPCR引物（反向） | CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT | ||
| FerhchRNAi引物（反向） | [TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC | ||
| FerhchRNAi引物（正向） | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG | ||
| FoxOqPCR引物（正向） | CTACGCCGATCTCATAACGC | ||
| FoxO qPCR引物（反向） | TGCTGTCGCCCTTGTCCT | ||
| 含gDNA Eraser的PrimeScript RT试剂盒（完美实时） | TaKaRa, 日本 | RR047A | |
| 实时定量PCR仪 | Bio-rad, 美国 | CFX 96 Touch | 用于进行逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR） |
| 实时PCR（TaqMan）引物与探针设计工具 | https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/ | ||
| T7 RiBoMAX Express RNAi系统 | Promega, 美国 | P1700 | 用于体外 in vitro 合成dsRNA |
TB Green Premix Ex TaqTM  （含RnaseH Plus） | TaKaRa, 日本 | RR820A | 用于进行RT-qPCR |
| 三氯甲烷 | 科试剂, 中国 | GB/T682-2002 | 用于提取RNA |
| TRIzol试剂 | Ambion, 美国 | 15596018 | 用于从样品中提取总RNA |
| 超低温冰箱 | Thermo, 美国 | Forma 911 |
参考文献
- Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status and perspectives. Annu Rev Entomol. 66, 463-484 (2020).
- Zhou, J. C., et al.
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