인간 면역 세포에서 미토콘드리아 막 전위의 동적 변화를 평가하기 위한 고분해능 폐활량 측정법

Summary

면역 세포에서 생리학적으로 관련된 기질 농도 하에서 미토콘드리아 생체 에너지학을 연구하는 방법은 제한적입니다. 당사는 고분해능 폐활량 측정법을 사용하여 인간 T 세포, 단핵구 및 말초 단핵 세포의 에너지 수요에 대한 미토콘드리아 막 전위의 반응 변화를 평가하는 상세한 프로토콜을 제공합니다.

Abstract

말초 단핵 세포(PBMC)는 건강과 질병에 반응하여 미토콘드리아 호흡 능력에 강력한 변화를 보입니다. 이러한 변화가 골격근과 같은 다른 조직에서 일어나는 일을 항상 반영하는 것은 아니지만, 이러한 세포는 인간 피험자로부터 생존 가능한 미토콘드리아의 접근 가능하고 가치 있는 공급원입니다. PBMC는 생체 에너지 상태에 영향을 미치는 전신 신호에 노출됩니다. 따라서 이 집단에서 미토콘드리아 대사를 조사하기 위한 도구를 확장하면 질병 진행과 관련된 메커니즘을 규명할 수 있습니다. 미토콘드리아의 기능적 분석은 종종 최대 기질, 억제제 및 언커플러 농도에 따른 호흡 출력을 사용하여 호흡 용량의 전체 범위를 결정하는 것으로 제한되며, 이는 생체 내에서 달성하지 못할 수 있습니다. ATP-합성효소에 의해 아데노신 이인산(ADP)이 아데노신 삼인산(ATP)으로 전환되면 미토콘드리아 막 전위(mMP)가 감소하고 산소 소비가 증가합니다. 미토콘드리아 역학에 대한 보다 통합된 분석을 제공하기 위해 이 기사에서는 고분해능 폐활량 측정법을 사용하여 생리학적으로 관련된 ADP 농도에 대한 산소 소비량과 미토콘드리아 막 전위(mMP)의 동시 반응을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 기법은 테트라메틸로다민 메틸에스테르(TMRM)를 사용하여 복합 I 및 II 기판의 최대 과분극 후 ADP 적정에 대한 반응으로 mMP 편광을 측정합니다. 이 기술은 노화 및 대사 질환과 같은 건강 상태의 변화가 인간 피험자의 PBMC, T 세포 및 단핵구에서 에너지 수요에 대한 미토콘드리아 반응의 민감도에 어떤 영향을 미치는지 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

생리적 스트레스 기간 동안 세포가 기능하고 생존할 수 있는 능력은 항상성을 회복하기 위한 에너지 요구 사항을 충족하는 능력에 크게 좌우됩니다 ^1,2. 에너지 수요는 다양한 자극에 반응하여 증가합니다. 예를 들어, 운동 중 근육 수축이 증가하면 골격근에 의한 ATP와 포도당의 이용이 증가하고, 감염 후 단백질 합성이 증가하면 면역 세포가 사이토카인 생산 및 증식을 위해 ATP를 이용합니다 3,4,5,6. 에너지 수요의 급증은 ATP/ADP 비율을 복원하기 위한 일련의 생체 에너지 과정을 촉발합니다. ATP가 소모됨에 따라 ADP 수치가 상승하고 F₁F₀ ATP-synthase (복합체 V)를 자극하는데, 이는 미토콘드리아⁷ 내에서 ADP의 기계적 회전 및 촉매 변환을 유도하기 위해 양성자력을 필요로 합니다. 양성자력은 내부 미토콘드리아 멤브레인 내의 전자 수송 시스템(ETS)을 통해 기질에서 산소로 전자를 전달하는 동안 양성자의 펌핑에 의해 생성되는 전기화학적 구배입니다. 그 결과 양성자 농도(델타 pH)와 전위(막 전위)의 차이는 에너지 수요에 대응하여 ATP 합성 및 산소 소비를 주도하는 양성자력을 생성하여 ATP/ADP 비율을 감소시키거나 ADP 수준을 높입니다. ADP에 대한 미토콘드리아의 친화도는 고립된 미토콘드리아 또는 투과성 세포의 ADP 자극 호흡_{의 KM 또는} EC₅₀의 계산에 의해 결정될 수 있다 ^8,9. 이 방법은 나이 든 인간의 투과성 근육 섬유가 젊은 피험자보다 최대 산화 인산화 능력의 50%를 자극하기 위해 더 많은 ADP 농도를 필요로 한다는 것을 보여주었습니다⁹. 마찬가지로, 노화된 쥐 골격근은 미토콘드리아 활성 산소종(ROS)의 생산을 낮추기 위해 더 많은 ADP를 필요로 합니다^10,11. 게다가, ADP 민감도는 규정식 유도된 비만을 가진 쥐의 침투성 근육 섬유에서 대조군에 비해 감소되고 인슐린의 존재 하에서 그리고 질산염 소비 후에 강화된다^12,13. 따라서 에너지 수요에 반응하는 미토콘드리아의 능력은 다양한 생리학적 조건에 따라 다르지만, 이는 이전에 면역 세포의 맥락에서 탐구된 적이 없습니다.

말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 일반적으로 인간 피험자 14,15,16,17,18,19,20에서 세포 생체 에너지를 조사하는 데 사용됩니다. 이는 주로 임상 연구에서 응고되지 않은 혈액 샘플에서 세포를 쉽게 얻을 수 있고, 대사 교란에 대한 세포의 반응성, 미토콘드리아 호흡의 최대 및 최소 용량을 결정하기 위해 억제제 및 언커플러를 사용하여 미토콘드리아 대사를 조사하기 위해 다양한 그룹에서 개발한 방법 때문입니다^21,22. 이러한 방법은 노화, 대사 질환 및 면역 기능에서 생체 에너지학의 역할에 대한 인식을 이끌어 냈습니다 14,20,23,24. 미토콘드리아 호흡 능력은 종종 심부전 상태에서 골격근과 PBMC에서 감소합니다^18,25. PBMC 생체 에너지학은 또한 건강한 성인¹⁷의 심장 대사 위험 요인과 상관 관계가 있으며 니코틴아미드 리보시드¹⁸와 같은 치료에 반응합니다. PBMC에는 호중구, 림프구(B 세포 및 T 세포), 단핵구, 자연 살해 세포 및 수지상 세포가 포함되며, 모두 PBMC 미토콘드리아 용량 26,27,28에 기여합니다. 또한 세포 생체 에너지학은 면역 세포 활성화, 증식 및 재생에 중요한 역할을 합니다²³. 그러나, 이러한 방법의 한계는 세포가 기질의 생리학적 범위 하에서 기능하지 않는다는 것이다. 따라서 세포가 생체 내에서 경험하는 것과 더 관련이 있는 기질 농도에서 미토콘드리아 기능을 조사하기 위한 추가 방법이 필요합니다.

미토콘드리아 막 전위(mMP)는 양성자 동력의 주요 구성 요소이며 호흡 플럭스 조절, 활성 산소 종 생산, 단백질 및 이온 가져오기, 자가포식 및 세포 사멸과 같은 ATP 생산 이외의 다양한 미토콘드리아 과정에 필수적입니다. mMP는 JC-1, Rhod123, DiOC₆, 테트라메틸 로다민(TMRE) 또는 메틸 에스테르(TMRM) 및 사프라닌과 같은 막 분극의 변화에 민감한 전기화학 프로브 또는 형광 염료로 평가할 수 있습니다. 후자의 두 가지는 조직 균질액, 분리 된 미토콘드리아 및 투과 조직 11,29,30,31,32,33의 고분해능 폐활량 측정에 성공적으로 사용 된 친유성 양이온 성 염료입니다. 이 기술에서 TMRM은 담금질 모드에서 사용되며, 세포는 편광 시 미토콘드리아 기질에 축적되는 고농도의 TMRM(높은 mMP 및 양성자력)에 노출되어 세포질 TMRM 형광의 소멸을 초래합니다. 미토콘드리아가 ADP 또는 언커플러에 반응하여 탈분극될 때, 염료는 매트릭스에서 방출되어 TMRM 형광 신호(^34,35)를 증가시킨다. 이 방법의 목적은 인간 유래 PBMCs, 순환 단핵구 및 T 세포에서 ADP 적정에 대한 반응으로 미토콘드리아 호흡 및 mMP의 변화를 동시에 측정하는 것이며 마우스 비장 T 세포에도 적용할 수 있습니다.

Protocol

본 명세서에 제시된 데이터 및 방법 개발을 위한 혈액 샘플 수집은 워싱턴 대학교의 내부 검토 위원회(Internal Review Board)의 승인을 받았다. 대표적인 결과에는 Jackson Laboratories에서 구입한 수컷 C57BL/6J 마우스(5-7개월령)의 데이터도 포함됩니다. 모든 동물 시술은 워싱턴 대학교 동물 복지 사무소의 승인을 받았습니다. 프로토콜 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 이 프로토콜에 대한 시약 준비는 보충 파일 1에서 찾을 수 있습니다. 그림 1: 프로토콜 개요. 고분해능 폐활량 측정법을 사용하여 신선한 인간 혈액 샘플에서 분리된 단핵구(CD14+) 및 T 세포(CD3+)의 미토콘드리아 막 전위 변화를 평가하는 워크플로우. 약어 : TMRM, 테트라 메틸 로다민 메틸 에스테르; SUIT, 기질-언커플러-억제제 적정; ADP, 아데노신 이인산; 발굴, 디지토닌; 말, 말레이트; Pyr, 피루브산; 과자, 글루타메이트; D1-10, 10회 연속 ADP 적정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 1. 전혈에서 버피 코트의 분리 참고: 세포 분리는 Kramer et al.27에서 수정되었습니다. RPMI, 밀도 구배 및 원심분리기가 실온에 도달하도록 합니다. 시작하기 전에 생물 안전 캐비닛과 재료를 멸균하십시오. 3개의 10mLK2EDTA 튜브에 정맥혈을 수집합니다. 튜브를 최소 3번 뒤집습니다. 500 x g 10분(22°C, 9 가속[acc], 2 감속[dec])에서 튜브를 원심분리합니다. 각 튜브에서 1mL의 혈장을 제거하고 향후 분석을 위해 -80°C에서 보관합니다. 각 튜브의 혈장과 적혈구층의 절반을 단일 50mL 원추형 튜브로 옮깁니다. RPMI를 최대 40mL 표시까지 추가합니다. 최소 3번 반전합니다. 10mL의 혈장 용액을 3mL의 밀도 구배가 들어 있는 4개의 15mL 코니컬 튜브에 천천히 층을 만듭니다. 700 x g 에서 30분 동안 원심분리기(22 °C, 5 acc, 2 dec). 적혈구를 방해하지 않고 말초 단핵 세포(PBMC)를 포함하는 모든 혈장과 버피 코트를 수집합니다. 500 x g 에서 10분(22 °C, 5 acc, 5 dec) 동안 원심분리하고 상층액을 흡입합니다. PBMC 펠릿을 10mL의 RPMI에 재현탁시키고 500 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 1x-2x 세척합니다(22 °C, 5 acc, 5 dec). 2. CD14+ 및 CD3+ 세포의 자기 분리 자기 셀 분리기의 자기장에 컬럼을 배치합니다( 재료 표 참조). RP-5 3mL로 컬럼을 세척합니다. PBMC 펠릿을 80μL의 RP-5 및 20μL의 항-CD14 마이크로비드에 재현탁시킵니다( 재료 표 참조). 4 °C에서 15분 동안 배양합니다. 1mL의 RP-5로 세포를 재현탁하고 현탁액을 컬럼에 로드합니다. “Flow-through 1″이라고 표시된 15mL 코니컬 튜브로 흐르는 라벨이 없는 세포를 수집합니다. 모든 세포 현탁액이 컬럼을 통과할 때까지 기다린 다음 3mL의 RP-5 3x로 계속 세척하여 모든 플로우스루를 수집합니다. 자기장에서 컬럼을 조심스럽게 제거하고 새 15mL 코니컬 튜브에 놓습니다. 5mL의 RP-5를 추가하고 즉시 플런저를 사용하여 컬럼 내용물을 “CD14+”라고 표시된 수집 튜브에 퍼지합니다. 500 x g에서 10분 동안(22 °C, 5 acc, 5 dec) “Flow-through 1″원심분리기를 하고 상층액을 흡입합니다. Flow-through 1의 세포를 사용하여 anti-CD3 마이크로비드(재료 표 참조)를 사용하여 2.2-2.5단계를 반복하여 T 세포를 분리합니다. T 세포(CD3+)와 단핵구(CD14+)를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리기 튜브. 상층액을 흡인하고 펠릿을 RP-5 1mL에 재현탁시킵니다. 혈구계 또는 자동 세포 카운터를 사용하여 세포 농도를 측정합니다.참고: 혈구측정기에 1:10 또는 1:20의 세포 희석 10μL를 추가하여 세포를 계수할 수 있습니다. 하나는 혈구계(36)를 사용하여 세포를 계수하기 위해 이전에 발표된 프로토콜을 참조할 수 있다. 250만 개의 단핵구 또는 500만 개의 T 세포를 새로운 원심분리 튜브로 피펫팅합니다. 2000 x g에서 30초 동안 원심분리하여 상층액을 흡입하고 MiR05의 세포를 재현탁시켜 총 부피 20μL, 최종 농도 1억 2,500만 개의 단핵구 또는 mL당 2억 5,000만 개의 T 세포를 만듭니다.참고: 최종 농도는 20μL의 부피에 250만 개의 단핵구 또는 500만 개의 T 세포를 주입하기 위해 선택되었으며, 비장에서 분리된 마우스 T 세포도 이 방법을 사용하여 테스트되었습니다. 절차는 보충 파일 1에서 찾을 수 있습니다. 3. 고분해능 폐활량 측정 – 산소 및 TMRM 형광 보정 참고: 이 방법은 Pharaoh et al.11이 투과성 섬유에 대해 수행한 이전 연구에서 채택되었습니다. TMRM의 높은 비억제성 농도는 매트릭스에서 mMP와 TMRM 농도의 관계가 반전되는 담금질 모드에 사용됩니다. 따라서, mMP의 감소는 매트릭스로부터 TMRM 염료의 방출과 형광의 증가로 이어진다(32). 제조업체의 지침에 따라 O2K 호흡계에 0.5mL 챔버를 설치합니다( 재료 표 참조). 기기를 켜고 데이터 수집을 위해 제조업체에서 제공한 소프트웨어에 연결합니다. 온도를 37°C로 조정하고 교반 속도를 750rpm으로 조정합니다. 증류수로 챔버를 3번 세척합니다. 물을 0.54mL의 Mir05로 교체하고 마개를 완전히 닫은 다음 통합 흡입 시스템(ISS)으로 과도한 버퍼를 제거합니다. 스토퍼 스페이서를 사용하여 실내 산소가 챔버 산소와 평형을 이룰 수 있도록 스토퍼를 올립니다. 산소 플럭스가 안정되면 제조업체의 지침에 따라 공기 산소 보정(R1)을 수행합니다.알림: 산소 플럭스가 안정화되는 데 >30분이 소요될 수 있습니다. 산소 센서는 디티오나이트 적정을 사용하는 별도의 실험에서 영점 산소(R0) 및 50-200μM의 배경 산소 플럭스를 측정해야 합니다. 구체적인 방법은 제조업체의 설명서에서 찾을 수 있습니다. 스토퍼를 닫아 챔버를 밀봉합니다.참고: 투과성 섬유를 사용하는 실험과 달리 챔버는 PBMC에 대한 과산소화가 필요하지 않습니다. R1 보정 후 챔버를 밀봉하면 실험에 충분한 산소가 제공됩니다. 산소 수준은 50-250μM 사이로 유지되어야 합니다. 산소 농도가 임계값 이하로 떨어지면 챔버 산소가 실내 공기 산소와 평형을 이룰 수 있도록 챔버를 부분적으로 열 수 있습니다. TMRM 캘리브레이션녹색 LED 형광 센서(예: 525nm)를 AmR 필터 세트와 함께 사용합니다( 재료 표 참조). 형광계 게인(Gain )을 1000 으로, 강도(Intensity) 를 1000으로 설정합니다. 형광 센서를 켜고 기준선 기록을 시작합니다. 2.5 μL의 0.05 mM TMRM을 주입하고 챔버에서 1 μM TMRM의 총 TMRM 농도에 대해 총 4 회 주입이 수행 될 때까지 다음 2.5 μL 주입 전에 신호가 안정화 (~ 2 분)되도록합니다. 모든 주사에는 Hamilton 주사기를 사용하십시오. 5점 보정을 위해 TMRM의 0, 0.25, 0.5, 0.75 및 1.0μM를 나타내는 각 주입에 대한 형광 신호(전압)를 선택하여 형광 센서를 보정합니다. 4. Substrate-uncoupler-inhibitor titration (SUIT) 프로토콜 참고: TMRM 신호는 주입만으로도 변하므로 20μL의 세포 현탁액 대신 20μL의 Mir05가 챔버에 주입되는 빈 실험을 실행합니다(대표 결과에서 논의됨). 블랭크 및 샘플 실험 모두에 대해 다음 주입 전에 산소 플럭스 신호가 안정화될 때까지(약 2-3분) 허용합니다. 다음 적정 프로토콜 및 예상 관찰치는 표 1에 나와 있습니다. 산소 플럭스가 안정되면 산소 플럭스와 TMRM 신호를 모두 선택하고 “pre-cell”로 레이블을 지정합니다. 500만 개의 T 세포 또는 250만 개의 단핵구를 포함하는 세포 현탁액을 ~20μL에 주입하고 약 10분 동안 측정합니다. 산소 플럭스와 TMRM 신호를 모두 선택하고 “Cell”로 레이블을 지정합니다. 1mg/mL 디지토닌 2μL(최종 농도: 4μg/mL)를 주입하여 세포를 투과시킵니다. 20분 동안 기다립니다. 산소 플럭스와 TMRM 신호를 모두 선택하고 “Dig”로 레이블을 지정합니다.참고: 별도의 실험에서 디지토닌 농도를 최적화하는 것이 좋습니다. 1M 숙시네이트 2.5μL를 추가합니다(최종 농도: 5mM). 산소 플럭스와 TMRM 신호를 모두 선택하고 “SUCC”로 레이블을 지정합니다. 산소 플럭스가 안정되면 5μL의 100mM 말레이트(최종 농도: 1.0mM), 5μL의 1M 글루타메이트(최종 농도: 10mM) 및 500mM 피루브산(최종 농도: 5mM)을 추가합니다. 산소 플럭스와 TMRM 신호를 모두 선택하고 “MPG”로 레이블을 지정합니다. 산소 플럭스가 안정되면 ADP를 적정합니다. 각 적정에 대한 비율을 선택하고 적정 횟수에 따라 1에서 10까지 순차적으로 “D”라는 라벨을 붙입니다. 표 2의 적정 방법을 사용하십시오. 산소 플럭스가 안정되면 형광 신호가 최대에 도달할 때까지 0.25mM 카르보닐 시안화물 p-(트리-플루로메톡시) 페닐-히드라존(FCCP)의 1μL 적정을 일련의 수행합니다. 최소 멤브레인 전위를 나타내는 산소 플럭스와 TMRM 신호를 모두 선택하고 레이블을 지정한 다음 “FCCP”로 레이블을 지정합니다.참고: 0.5-1.0 μM의 FCCP 농도는 일반적으로 미토콘드리아 막 전위를 고갈시키는 데 필요합니다.주의: FCCP는 독성이 있습니다. 올바른 취급을 위해 안전보건자료(SDS)를 참조하십시오. 선택 사항: 산소 플럭스가 안정되면 0.25mM 로테논 1μL를 주입하여 복합체 I을 억제하고 복합체 II를 통해 호흡 용량을 결정합니다.참고: 멤브레인 전위의 변화는 언커플러로 적정한 후 더 이상 관련이 없습니다.주의: 로테논은 독성이 있습니다. 적절한 취급을 위해 SDS를 참조하십시오. 산소 플럭스가 안정되면 1μL의 1.25mM(최종 농도: 2.5μM)의 Antimycin A를 주입하여 미토콘드리아 호흡을 억제합니다.주의: 항마이신 A는 독성이 있습니다. 적절한 취급을 위해 SDS를 참조하십시오. 5. 미토콘드리아 막 전위 계산 및 분석 blank experiments를 사용하여 blank sample(“pre-sample”) 주입 전과 각 주입에 대해 보정된 TMRM 값(마이크로몰 TMRM)을 기록합니다. 그림 2를 참조하십시오. 각 빈 실험에 대해 “사전 샘플링” TMRM 농도를 1.0으로 설정하여 배경 비율을 계산합니다. TMRM의 후속 비례 감소를 계산합니다. 모든 빈 실험의 평균 배경 비율을 계산합니다.참고: 포함할 빈 실험의 수는 기기의 정밀도에 따라 달라질 수 있습니다. 5개의 서로 다른 빈 실험에서 얻은 표 3 의 계산 예를 보면, 각 적정에 대해 평균 배경 비율의 표준 편차가 0에서 0.016 사이였습니다. 배경 계산: 샘플 실험의 “사전 샘플” TMRM에 각 주입의 평균 배경 비율을 곱하여 각 샘플 실험의 배경을 계산합니다. 표 3의 계산 예를 참조하십시오. 배경 보정: 샘플의 측정된 TMRM 값에서 실험의 배경을 뺍니다. 표 4의 계산 예를 참조하십시오. FCCP 보정: 각 주입에서 FCCP 배경 보정된 mMP를 뺍니다. 표 4의 계산 예를 참조하십시오. ADP 민감도 곡선: ADP 적정 전반에 걸쳐 수집된 mMP 값을 사용하여 가장 높은 멤브레인 전위와 가장 낮은 멤브레인 전위를 각각 100% 및 0%로 설정하여 ADP에 의한 mMP 감소를 정규화합니다. mMP에 대한 ADP의 절반 최대 억제 농도(IC50)를 계산하기 위해 선호하는 통계 소프트웨어를 사용하여 데이터를 비선형 피팅 회귀 모델에 피팅합니다.참고: 곡선은 Prism의 [Inhibitor] 대 정규화된 반응 – 가변 기울기에 적합합니다. 그림 2: TMRM 형광에서 미토콘드리아 막 전위(mMP) 및 ADP 감도 계산. T 세포 샘플 1개에 대한 고분해능 폐활 측정법으로 TMRM 형광 측정에서 미토콘드리아 막 전위(mMP) 및 ADP 감도를 계산하는 단계(n = 1). 1단계: TMRM 형광은 생물학적 샘플에서와 같이 블랭크 샘플에서 측정됩니다. 2단계: 각 블랭크 실험에 대한 샘플 이전 신호에 대해 각 적정과 함께 TMRM 신호의 비율을 결정합니다. 모든 빈 실험의 각 적정에 대한 평균을 계산합니다. 3단계: “사전 샘플” 형광에 각 적정에 대한 평균 배경 비율을 곱하여 각 샘플 실험의 배경을 계산합니다. 4단계: 각 적정에 대한 배경 및 샘플 TMRM 형광 간의 차이를 계산하여 데이터를 mMP 또는 미토콘드리아 TMRM 흡수로 표현합니다. 5단계: FCCP와의 완전한 분리가 0mMP를 반영하도록 mMP를 수정합니다. 6단계: 비선형 회귀를 수행하여 ADP 농도가 증가함에 따라 mMP의 변화를 그래프로 표시합니다. 측정은 0.5mL 챔버에서 수행되었으며, 그 중 하나에는 건강한 지원자의 500만 개의 T 세포가 포함되어 있었습니다. 평균 데이터는 평균± SEM으로 표현되며, 단일 반복실험의 단일 데이터 점은 오차 막대 없이 표현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Representative Results

분석을 위한 최적 세포 농도의 차이를 설명하기 위해 500만 개의 T 세포를 하나의 0.5mL 챔버(1,000만 세포/mL)에 로드하고, 125만 개의 세포를 1μM TMRM이 포함된 다른 챔버(250만 세포/mL)에 로드했습니다(그림 3A-G). TMRM 배경을 계산하기 위해 3개의 빈 실험도 포함되었습니다. 우리는 T 세포의 농도가 높을수록 배경에 비해 TMRM 형광에서 더 뚜렷한 변화를 초래한다는 것을 발견했습니다(그림 3B, D). 또한 세포 농도가 높을수록 FCCP 첨가에 대한 반응으로 예상되는 산소 소비량 증가와 mMP의 동시 고갈을 감지할 수 있었습니다(그림 3E, F). 낮은 농도의 세포를 사용하면 배경과 평행한 형광의 약한 변화가 생성되었습니다. mMP의 계산은 신호에서 배경을 빼기 때문에 낮은 셀 농도는 기판 및 언커플러에 대한 mMP의 변화를 결정할 수 없습니다. 이 분석에서 더 높은 농도의 세포를 사용하는 것 외에도 실험 간에 각 세포 유형에 대해 세포 농도를 일정하게 유지하는 것이 좋습니다. ADP 적정으로 mMP의 소멸에 대한 ATP-synthase의 영향을 검증하기 위해, ADP 적정 전에 한 챔버에 올리고마이신을 투여한 PBMC 및 T 세포에 대한 병렬 실험을 실행했습니다(그림 4). 올리고마이신(oligomycin)으로 처리한 세포에서 ADP에 대한 반응으로 mMP가 소실되지 않았으며, 이는 ADP를 동반한 mMP의 점진적인 감소가 ATP-synthase를 통한 양성자 플럭스의 결과임을 시사합니다(그림 4A-F). 또한 동일한 참가자의 T 세포와 PBMC 간의 ADP 민감도를 비교한 결과 T 세포 분획에서 ADP 민감도가 더 낮은(더 높은 EC50) 것으로 나타났습니다(그림 4G,H). TMRM 형광에 대한 시간 또는 SUIT 프로토콜의 영향을 확인하기 위해 일련의 빈 실험을 수행했습니다. 블랭크 실험에서 TMRM 신호는 적정 타이밍(그림 5B)과 달리 대부분 SUIT 적정(그림 5A)의 영향을 받는다는 것을 발견했습니다. 우리는 11명의 건강한 지역사회 거주 지원자의 T 세포 및 단핵구에서 산소 소비량(OCR)과 mMP의 ADP 주도 변화를 비교했습니다(그림 6A-H). 세포외 플럭스 및 효소 분석을 사용하여 이전에 발표된 실험의 결과와 유사하게, 단핵구는 림프구26,27보다 더 큰 미토콘드리아 호흡 능력을 나타 냈습니다(그림 6A,H). 그러나 두 세포 유형 모두에서 ADP를 동반한 OCR의 전형적인 용량-반응 증가를 감지하지 못했으며(그림 6C,D), 이는 이 방법이 마우스 간과 같은 대사율이 높은 조직을 사용할 때 나타나는 것과 반대입니다(그림 7A-H). 반면에, TMRM을 사용하여 인간 면역 세포(그림 6E-G)와 생쥐의 비장 T 세포(그림 7E-H)에서 ADP를 동반한 mMP의 점진적인 감소를 감지할 수 있었습니다. 동일한 적정 프로토콜을 사용하여 인간 및 마우스 T 세포를 직접 비교하지는 않았지만 마우스 T 세포의 IC50이 인간 피험자의 순환 T 세포에 비해 10배 낮다는 것을 발견했습니다. 그림 3: 고분해능 폐활량 측정 실험. (A-D) 0.5mL 챔버에서 1,000만 cells/mL 및 250만 cells/mL의 T 세포 농도를 사용한 고분해능 폐활량 측정 실험의 흔적. (A) 0.5mL 챔버에서 1,000만 세포/mL. (C) 0.5mL 챔버에서 250만 세포/mL. 산소 플럭스(pmol/s/mL)는 상단 패널(빨간색)에 표시되고 보정된 TMRM 신호는 하단 패널(검은색)에 표시됩니다. (B) 1,000만 cells/mL 및 (D) 250만 cells/mL를 포함하는 챔버에 대해 샘플에 대한 SUIT 전체의 TMRM 변화와 계산된 배경을 표시했습니다. (E) 각 세포 농도에 대해 산소 플럭스(pmol/s/백만 개 세포) 및 (F) 미토콘드리아 막 전위를 계산했습니다. (G) ADP 민감도 곡선을 플롯하고 비선형 회귀 모델(실선)에 맞췄습니다. 약어: mMP, 미토콘드리아 막 전위; TMRM, 테트라메틸로다민 메틸 에스테르; SUIT, 기질-언커플러-억제제 적정; ADP, 아데노신 이인산; 발굴, 디지토닌; 말, 말레이트; Pyr, 피루브산; 과자, 글루타메이트; D1-11, 11회 연속 ADP 적정; U, 0.5 및 1.0 μM의 언커플러 FCCP; AMA, antimycin A. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4: ATP-synthase는 T 세포 및 PBMC에서 ADP에 의한 막 전위 감소를 주도합니다. (AH) 여기에 설명된 프로토콜은 PBMC 및 T 세포에서 테스트되었습니다. 2개의 O2K 챔버에 PBMC를 주입하고, 추가 O2K의 2개 챔버에 동일한 참가자의 T 세포를 주입했습니다. 모든 챔버에 말레이트, 피루브산, 글루타메이트 기질을 주입한 후 PBMC 및 T 세포의 한 챔버에 올리고마이신을 투여했습니다. 올리고마이신은 (A) PBMC 및 (D) T 세포에서 ADP에 의한 호흡 증가 또는 (B,C) PBMC 및 (E,F) T 세포에서 미토콘드리아 막 전위의 감소를 방지했습니다. (지,H) ADP 민감도는 T 세포에 비해 PBMC에서 더 높았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 5: 블랭크 실험은 기판, 언커플러 및 억제제(SUIT)의 시간 및 적정에 대한 반응으로 TMRM 형광의 변화를 보여줍니다. (A) 적정에 대한 TMRM 형광의 변화. (B) 시간에 따른 TMRM 형광의 변화. 실험은 1μM TMRM을 포함하는 Mir05로 채워진 0.5mL 챔버에서 수행되었습니다. 한 챔버는 SUIT 적정을 받지 않았습니다(주입 없음). 두 개의 다른 기기에 있는 두 개의 챔버는 표준 슈트 프로토콜(표준 주입)을 받았습니다. 한 챔버는 동일한 SUIT 적정을 받았지만 각 주입 사이에 지연(지연된 주입)이 있었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 6: OCR과 mMP를 사용한 T 세포와 단핵구 간의 ADP 민감도 차이. (A) 피험자의 단핵구 및 T 세포 샘플에서 채취한 고분해능 폐활량 측정 실험의 흔적. (B) 건강한 지원자의 혈액에서 추출한 단핵구(n= 11) 및 T 세포(n= 13)의 산소 소비량. (씨,디) EC50을 계산하기 위해 ADP 적정을 사용하여 플롯된 호흡 상승을 비선형 회귀 분석으로 피팅합니다. (E) 미토콘드리아 막 전위의 동시 측정. (에프,지) IC50을 계산하기 위해 ADP 적정을 사용하여 미토콘드리아 막 전위의 플롯된 감소를 피팅하는 비선형 회귀 분석. (H) 단핵구와 T 세포의 호흡 능력 매개변수. 데이터는 선 그래프의 경우 평균 ± SEM으로 표현되고 막대 그래프의 경우 평균 ± SD로 표현됩니다. t-검정 후 통계적으로 유의한 차이는 *p < 0.05로 표현됩니다. **p는 0.01<, ****p는 0.0001<. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 7: 투과화된 마우스 비장 T 세포 및 간에서 호흡과 미토콘드리아 막 전위(mMP)의 ADP 반응 비교. (A-D) 투과화된 마우스 비장 T 세포 및 간에서의 호흡 반응. (E-H) 투과성 마우스 비장 T 세포 및 간에서 mMP의 반응. 신선한 간과 비장은 자궁 경부 탈구 후 3 마리의 마우스에서 절개되었습니다. Splenic Pan T-cell은 antibody-conjugated magnetic bead separation을 사용하여 분리하였다. 두 샘플 모두 1μM TMRM이 있는 상태에서 동일한 SUIT 프로토콜을 거쳤습니다. (나,J) 산소 소비량(OCR)의 증가로 계산한 EC50과 ADP에 따른 mMP의 감소로 계산한 IC50의 비교. N = 그룹당 3개. 데이터는 SEM± 평균으로 표현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 표 1: 0.5mL 챔버를 사용하여 갓 분리된 T 세포 및 단핵구에서 미토콘드리아 막 전위를 평가하기 위한 SUIT 프로토콜의 예. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 표 2: 0.5 mL 챔버에 대한 권장 ADP 적정. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 표 3: 5개의 독립적인 빈 실험을 사용하여 평균 배경 비율 계산. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 표 4: 샘플 실험에서 미토콘드리아 막 전위(mMP) 계산. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 그림 1: Mir05 및 DMSO가 미토콘드리아 호흡 및 막 전위에 미치는 영향. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 1: 마우스 비장에서 T 세포를 분리하기 위한 시약 준비 및 프로토콜. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 프로토콜은 고분해능 폐활량 측정법을 사용하여 PBMC, 단핵구 및 T 세포에서 ADP 수준 증가에 따른 mMP의 소실을 측정함으로써 에너지 수요에 대한 미토콘드리아 반응의 민감도를 측정합니다. 이는 미토콘드리아 막 전위를 최대화하기 위해 복잡한 I 및 II 기질을 추가하고 ADP를 적정하여 ATP-synthase를 점차적으로 자극하여 ATP 생성을 위한 양성자 구배를 사용하도록 함으로써 수행됩니다.

프로토콜의 중요한 단계에는 형광단의 이득과 강도를 1000으로 설정하고 TMRM 적정 중에 TMRM 형광 신호가 획득되도록 하는 것이 포함됩니다. TMRM 형광은 각 적정 후에 감소하기 때문에(이 방법의 한계) 빈 샘플을 사용하여 백그라운드 실험을 실행하는 것이 필수적입니다. 또한 DMSO가 미토콘드리아 호흡 및 막 전위에 억제 효과가 있음을 발견했으므로 Mir05에서 TMRM의 작동 용액을 희석하는 것이 좋습니다(보충 그림 1).

이 프로토콜을 시도할 때 사용할 수 있는 일부 수정 사항은 세포 농도를 조정하고 표준 2mL 챔버를 사용하는 것입니다. 그러나 0.5mL 챔버는 막 전위 및 산소 플럭스에서 최적의 반응에 필요한 세포 농도가 높기 때문에 T 세포 및 단핵구에 선호됩니다. 대식세포와 같이 호흡 능력이 더 큰 세포를 검사할 때는 더 낮은 농도의 세포가 최적일 수 있습니다.

여기에 제시된 방법의 추가적인 제한 사항에는 적어도 500만 개의 T-세포 및 250만 개의 단핵구에 대한 요구가 포함된다. 우리는 종종 건강한 참가자로부터 ~20mL의 혈액에서 충분한 세포를 얻을 수 있지만, 이 수치는 건강 상태, 연령 및 성별에 따라 다를 수 있습니다²⁶. 또한 미토콘드리아 용량을 평가하는 대부분의 방법과 마찬가지로 세포를 새로 분리해야 합니다. 그러나 이 방법은 미래에 동결 보존된 세포에서 시도될 수 있습니다. 인간 혈액의 수율과 비교하여, 건강한 쥐의 비장에서 얻은 T 세포 수율은 이 분석을 수행할 수 있을 만큼 충분히 높습니다.

순환하는 T 세포, 특히 장수명 기억(T_M) 및 조절(Treg) 세포는 에너지를 위해 산화적 인산화에 의존한다³⁷. 이들의 에너지 요구량과 산소 소비량은 낮지만(예: 휴식 중인 근육에 비해), 이들의 생존은 재감염 및 암에 대한 효과적인 면역 반응을 위해 필수적이다 38,39,40. T-세포 산화적 인산화의 감소는 증식 능력을 손상시키고 T-세포 고갈과 노화를 촉진한다 ^5,41. 또한, 미토콘드리아 과분극은 활성화 동안 effector CD4 T cell에 의한 cytokine(IL-4 및 IL-21)의 지속적인 생산을 촉진합니다⁴². 감염 시, 면역 세포의 활성화 및 증식을 위한 에너지 요구량은 기초 대사율의 25%-30%까지 높을 수 있다⁴³. 따라서 면역 세포는 광범위하고 극단적인 범위의 에너지 요구량에서 기능하며, 이 프로토콜은 해당 범위 내에서 미토콘드리아 반응을 테스트할 수 있습니다.

만성 염증은 비만, 당뇨병 및 노화의 일반적인 특징입니다. 순환 호르몬, 지질 및 포도당의 조절 장애 수준은 전신에 영향을 미치므로 미토콘드리아가 에너지 도전에 반응하는 방식에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에서는 순환 PBMC에서 미토콘드리아 ADP 민감도를 평가하는 방법을 제시했습니다. ADP 민감도가 대사 질환에서 어떻게 조절될 수 있는지, 그리고 그것이 건강 상태에 어떤 영향을 미치는지 결정하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.

Materials

Adenosine Diphosphate	Sigma-Aldrich	A5285	Fluorespirometry
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674	Fluorespirometry
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A6003	Mir05 buffer
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A6003	Cell isolation
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma-Aldrich	C2920	Fluorespirometry
Cell strainers	Fisher Scientific	22-363-548	Isolation of T-cells from mouse spleen protocol
CD14 Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-201	Cell isolation
CD3 Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-101	Cell isolation
DatLab	Oroboros	Version 8
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141	Fluorespirometry
D-Sucrose	Sigma-Aldrich	84097	Mir05 buffer
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E4378	Mir05 buffer
Filter Set AmR	Oroboros	44321-01
HBSS (10x)	Gibco	12060-040
HEPES sodium salt	Sigma-Aldrich	H7523	Mir05 buffer
Histopaque 1077	Sigma-Aldrich	10771	Cell isolation
K2EDTA blood collection tubes	BD Vacutainer	366643	Cell isolation
Lactobionic acid	Sigma-Aldrich	153516	Mir05 buffer
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G1626	Fluorespirometry
L-Malic Acid	Sigma-Aldrich	M1000	Fluorespirometry
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	Cell isolation
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M9272	Mir05 buffer
Multi-MACS stand and MidiMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-301	Cell isolation
O2k-Fluo Smart-Module	Oroboros	12100-03
O2k-FluoRespirometer series J	Oroboros	10201-03
O2k-sV-Module (0.5 chamber)	Oroboros	11200-01
Oligomycin	Sigma-Aldrich	04876	Fluorespirometry
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi	130095130	Isolation of T-cells from mouse spleen protocol
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662	Mir05 buffer
Potassium Hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	221473	Mir05 buffer
Prism	GraphPad	Version 10
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Fluorespirometry
RPMI Buffer	Corning	17-105-CV	Cell isolation
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	Fluorespirometry
Succinate disodium salt	Sigma-Aldrich	S2378	Fluorespirometry
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625	Mir05 buffer
Tetramethyrhodamine methyl ester perchlorite	Sigma-Aldrich	T5428	Fluorespirometry