אנו מראים כי ביטוי יתר של קולטני אפידרמיס גורם גדילה (EGFR) משפר את תנועתיות של בתאי גזע עצביים (NSCs) באמצעות מכשיר agarose רומן ג'ל microfluidic מבוסס. טכנולוגיה זו ניתן להתאמה בקלות מערכות אחרות תא יונקים שבו מקורות תא נדירים, כגון אדם בתאי גזע עצביים, ועל להסתובב הזמן הוא קריטי.
Abstract
בעוד הטכנולוגיה microfluidic הוא להגיע לרמה חדשה של בגרות עבור מבחני macromolecular, מבוססי תאים מבחני נמצאים עדיין בשלב תינוק 1. זהו בעיקר בשל הקושי שבה ניתן ליצור microenvironment תא תואם ויציב באמצעות טכניקות microfabrication קונבנציונאלי וחומרים. אנו לטפל בבעיה זו באמצעות הקדמה של חומר microfabrication רומן, agarose ג'ל, כחומר בסיס עבור המכשיר microfluidic. Agarose ג'ל הוא נזיל מאוד, החדיר את גז וחומרים מזינים הנחוצים להישרדות התא, ובכך חומר אידיאלי עבור מבוססי תאים מבחני. הראינו בעבר כי agarose מכשירים מבוססי ג'ל הצליחו ללמוד נדידת תאים חיידקיים נויטרופילים 2. בדו"ח זה, בשלושה ערוצים מקבילים microfluidic הם בדוגמת בקרום ג'ל agarose בעובי 1 מ"מ בערך. תזרים קבוע עם התקשורת / חיץ נשמרים בשני ערוצי הצד באמצעות משאבת peristaltic. תאים נשמרים בערוץ במרכז לצורך השגחה. מאז מזינים וכימיקלים בערוצים לוואי לשדר כל הזמן מהצד למרכז הערוץ, את הסביבה הכימית של הערוץ במרכז נשלטים בקלות באמצעות זרימת לאורך תעלות הצד. שימוש במכשיר זה, אנו מראים כי תנועת בתאי גזע עצביים ניתן לנטר אופטית בקלות בתנאים כימיים שונים, את תוצאות הניסוי הראו כי ביטוי יתר של קולטני אפידרמיס גורם גדילה (EGFR) משפר את תנועתיות של בתאי גזע עצביים. תנועתיות של בתאי גזע עצביים הוא סמן חשוב להערכת האגרסיביות תאים, ובכך גורם tumorigenic 3. פיענוח המנגנון הבסיסי תנועתיות NSC תניב תובנה הן הפרעות התפתחות סרטן עצביים אל המוח הפלישה בתאי גזע.
Protocol
נוהל ציפוי שקופיות עם פיברונקטין לפני ההרכבה של המכשיר microfluidic, לעקר שקופיות הזכוכית עם פיברונקטין. המעיל שקופיות biohood לשמור על סטריליות. יישר spacer סטרילי PDMS בשולי השקופית ולסמן את הצד שהוא פונה כלפי מעלה עם …
Discussion
איור. 1 מראה מסלולים של שלושה זנים NSC, התאים הורית, wtEGFR ואת ΔEGFR (שליטה). כל סט של מסלולי התקבלו בסרט 5 שעות ארוכות. עבור תאים הורית, תנועתיות התא הגיע לשיאו כאשר ריכוז EGF היה ~ 10ng/ml; עבור תאים wtEGFR, תנועתיות שיא התא עבר 100ng/ml או לעיל; עבור תאים ΔEGFR, תנועתיות התא היה עצמאי של ריכוז EGF כצפוי. </p…
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי משרד של מדינת ניו יורק למדע, טכנולוגיה ומחקר אקדמי (NYSTAR) (בצורה של מרכז עבור טכנולוגיה מתקדמת מענק), וכן על ידי מענקים ממרכז Nanobiotechnology (NBTC), תוכנית STC הלאומי קרן המדע על פי הסכם מס 'ECS-9876771, והמוח האמריקאי גידול עורכי הדין בניו יורק, האקדמיה לרפואה (ג'ב).
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)
Reagent
Invitrogen
11971-025
CO2-independent media
Reagent
Invitrogen
18045-088
A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine
Trypsin-EDTA
Reagent
Invitrogen
25200-072
PBS
Reagent
Invitrogen
14190-144
Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium
Pen/Strep
Reagent
Invitrogen
15140-122
Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline
FBS
Reagent
Invitrogen
10437-028
Fetal Bovine Serum, Qualified
Horse Serum
Reagent
Invitrogen
16050-130
Horse Serum, EIA tested (negative) serum
Fibronectin
Reagent
Sigma-Aldrich
F0895
Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin
EGF
Reagent
Sigma-Aldrich
E4127
Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized
Wong, K., Ayuso-Sacido, A., Ahyow, P., Darling, A., Boockvar, J. A., Wu, M. Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (12), e674, doi:10.3791/674 (2008).