Druk polijsten pipetten voor verbeterde patch-clamp opnemen
Summary
Dit is een gids voor het wijzigen van de vorm van glas micropipetten. In het bijzonder door gebruik te maken van warmte en luchtdruk van de taper is verbreed zonder verhoging van de tip opening, wat leidt tot een lagere weerstand pipet. Dit is essentieel voor het lage geluidsniveau opnamen van kleine cellen te verkrijgen, maar is nuttig in tal van toepassingen.
Abstract
Druk-polijsten is een methode voor het vormgeven van glazen pipetten voor de patch-clamp opname. We hebben eerst ontwikkelde deze methode voor het vervaardigen van pipetten geschikt voor het opnemen van kleine (<3 m) neuronale cellichamen. Het basisprincipe is vergelijkbaar met glasblazen en combineert de luchtdruk en warmte te wijzigen de vorm van de patch pipetten voorbereid door een conventionele micropipet trekker. Het kan worden toegepast op de zogenaamde soft (soda lime) en hard (borosilicaat) bril. In het algemeen, de druk polijsten kan verminderen pipet weerstand met 25% zonder het verminderen van de diameter van de tip opening (Goodman en Lockery, 2000). Het kan worden toegepast op vrijwel elk type van glas en vereist slechts de toevoeging van een hoge druk ventiel en passend bij een microforge. Deze techniek is essentieel voor het opnemen van ultrakleine cellen (<5 m) en kan single-channel recording ook verbeteren door het minimaliseren van pipet weerstand. De stompe vorm is ook nuttig voor geperforeerde-patch clamp opnamen, omdat deze tip vorm resulteert in een groter membraan blaar beschikbaar voor perforatie.
Protocol
Discussion
We oorspronkelijk ontwikkelde deze methode om pipetten nuttig voor patch-clamp opnamen 2-3 um neuronen in C. elegans 1. Het is in routine gebruik in het laboratorium Goodman. Wij druk polijsten pipetten niet alleen voor het opnemen van de kleine C. elegans neuronen, maar ook voor het verkrijgen van macropatch en single-channel opnames van ionenkanalen, uitgedrukt in Xenopus oöcyten. Voor een gegeven tip-opening met een diameter, de stompe vorm zorgt voor een lagere weerstand pipet. Lagere pipet weerstand leidt …
Acknowledgements
De druk-polishing-techniek werd ontwikkeld in samenwerking met de SR Lockery.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Glass Capillaries | Consumable | Sutter Instruments | BF150-85-10 (or similar) | The method works with any type of capillary except those made from quartz. However, we recommend using capillaries with a filament. |
| Inverted Microscope | Microscope | Leica | DM IL (or similar) | Any simple inverted microscope will do. However, it is essential to have sufficient magnification to see pipettes during polishing. We use a 100x metallurgical lens with a long working distance for this purpose. |
| Microforge Kit | Tool | ALA Science | CPM-2 | Supplies polishing coil, controller and foot pedal. |
| Air pressure source | Tool | ALA Science | PR-60 | Accessory for providing high pressure, includes a suitable valve. Alternatively, compressed air from the building can be used together with a filter/regulator (set to 40 PSI) and a 4-way valve (see below) |
| 4-way valve | Tool | Cole-Parmer | A-98150-01 | Fittings will be needed to couple valve to tubing |
| Pipette Holder with Luer Connector | Tool | World Precision Instruments | MPH-6S20 | Use a male luer-to-barb fitting to connect pipette holder to high-pressure tubing |
| Tygon® tubing | Tool | Cole-Parmer | 06408-62 | Use this tubing to connect pipette holder to 4-way valve |
References
- Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. . J Neurosci Methods. 100, 13-15 (2000).
