Druk polijsten pipetten voor verbeterde patch-clamp opnemen

Summary

Dit is een gids voor het wijzigen van de vorm van glas micropipetten. In het bijzonder door gebruik te maken van warmte en luchtdruk van de taper is verbreed zonder verhoging van de tip opening, wat leidt tot een lagere weerstand pipet. Dit is essentieel voor het lage geluidsniveau opnamen van kleine cellen te verkrijgen, maar is nuttig in tal van toepassingen.

Abstract

Druk-polijsten is een methode voor het vormgeven van glazen pipetten voor de patch-clamp opname. We hebben eerst ontwikkelde deze methode voor het vervaardigen van pipetten geschikt voor het opnemen van kleine (<3 m) neuronale cellichamen. Het basisprincipe is vergelijkbaar met glasblazen en combineert de luchtdruk en warmte te wijzigen de vorm van de patch pipetten voorbereid door een conventionele micropipet trekker. Het kan worden toegepast op de zogenaamde soft (soda lime) en hard (borosilicaat) bril. In het algemeen, de druk polijsten kan verminderen pipet weerstand met 25% zonder het verminderen van de diameter van de tip opening (Goodman en Lockery, 2000). Het kan worden toegepast op vrijwel elk type van glas en vereist slechts de toevoeging van een hoge druk ventiel en passend bij een microforge. Deze techniek is essentieel voor het opnemen van ultrakleine cellen (<5 m) en kan single-channel recording ook verbeteren door het minimaliseren van pipet weerstand. De stompe vorm is ook nuttig voor geperforeerde-patch clamp opnamen, omdat deze tip vorm resulteert in een groter membraan blaar beschikbaar voor perforatie.

Protocol

Pulling pipetten

Met behulp van een gloeidraad trekker, zoals een Sutter P-97 Flaming / Brown micro-elektrode Puller, trek een set van ongeveer 10-20 pipetten.

1. Kies uw glas. We maken gebruik van borosilicaat (BF150-86-10, OD = 1,5 mm, ID = 0,86 mm). Zorgvuldig op te slaan, zodat het glas blijft schoon en stofvrij.
2. Ontwerp een programma te trekken. Het primaire doel is een tip opening van ongeveer de gewenste grootte, dat zal afhangen van de toepassing. Sutter's P-97 Pipetteer Cookbook ² is een uitstekende referentie.
3. Observeer uw pipetten onder een microscoop om de opening met een diameter en gladheid te bepalen. Gooi ruw, oneffen of onregelmatig tips. Voor standaard patch-clamp-opname, een tip opening die is 2-4 um over is het beste. Een stompe punt leidt tot een weerstand lager voor dezelfde opening diameter, die de voorkeur heeft. Vorm en grootte kan worden gewijzigd tijdens het polijsten, hieronder.

Druk polijsten pipetten

1. Bevestig een pipet houder een schone, gecomprimeerde lucht lijn. Met behulp van een regulator, die de samengeperste lucht de druk op de ~ 40 PSI. Sluit de perslucht lijn naar een 4-weg regelklep die het mogelijk maken de pipet houder druk om in-en uitgeschakeld. Sluit een pipet houder de regelklep met een lengte van ⅛ in Tygon ® buizen.
2. Gebruik een polijsten rig (microforge) met een hoge druk pipet houder, een polijst spoel bestuurd door een voet-pedaal, een microscoop is uitgerust met een lage en hoge vergroting, lange werkdagen afstand (ideaal, 10x en 100x) lucht doelstellingen. Het is cruciaal om te kunnen de pipet opening observeren tijdens het protocol.
3. Optioneel: Coat de pipet met een hydrofoob isolatiemateriaal om de capaciteit te verminderen en verbeteren van geluid kenmerken (zie "Pulling pipetten" voor deze techniek).
4. Controleer of de druk klep in de uit-stand. Plaats een pipet in de pipet houder en draai de fitting tot handvast.
   
   Veiligheid opmerking: Als de pipet wordt strak gehouden in de pipet houder, de luchtdruk zorgt ervoor dat de pipet worden uitgeworpen uit de pipet houder.
   
   
5. Plaats de pipet en houder in de microforge. Plaats de pipet houder op de microscoop podium, zodat zowel de tip en het polijsten spoel zichtbaar bij lage (10x) macht op het microforge. Breng de tip ~ 75 micron uit de gloeidraad. Houd er rekening mee dat de gloeidraad zal uitbreiden bij verhitting.
6. Schakel over naar het hoge vermogen (100x) doelstelling. Zowel de pipetpunt en het polijsten spoel moet in focus en op het gebied van weergave. Zo niet, stel de hoogte van het polijsten spoel. (De pipet positie kan niet worden aangepast). De pipet tip en polijsten coil moet dicht bij tegenoverliggende zijden van het gezichtsveld. Vermijd het plaatsen van de spoel te dicht bij de pipetpunt want het zal zich uitbreiden naarmate deze warmer en bump in je pipet.
7. Draai de afsluiter onder druk lucht direct in de pipet, en verwarm de pipetpunt totdat de conus achter de punt begint te ballon naar buiten.
8. Stop het verwarmen voordat de tip ballonnen ook uitgebreid. Experimenteren is nodig om de juiste afstand, warmte, en de tijd te bepalen voor de gewenste vorm.
9. Optioneel: Verminder de tip opening met een diameter van polijsten van de tip in de afwezigheid van druk. Stap 7 en 8 kan herhaald om fine-tunen zowel de vorm en afmetingen van de pipetpunt.
10. Schakel de druk en ingedrukt terwijl u de pipetpunt in een veilige richting, verwijder de pipet en plaats het in een schone bewaardoos waar het zal worden beschermd tegen stof.
    
    Veiligheid opmerking: Als de luchtdruk is niet uitgeschakeld, de pipet kan worden uitgeworpen uit de pipet houder tijdens het verwijderen.

Opmerkingen over de microforge

We maken gebruik van een microforge samengesteld uit off-the-shelf commercieel verkrijgbare onderdelen. (U kunt een druk polijsten kit ook kopen van een paar bedrijven, bijvoorbeeld, ALA Science, GlassWorx). Ongeacht de microforge, is het essentieel om zijn optiek die goed genoeg is om de tip opening, die vaak slechts een paar micrometer in diameter te zien. We maken gebruik van een lange-werkafstand 100x lens voor dit doel. Ook vacht het polijsten spoel met hoge smelttemperatuur glas te minimaliseren storten verdampte metaal op de pipetten.

Deel 3: de verwachte resultaten

Matige druk polijsten kan verminderen de weerstand van een pipet, zonder een merkbare verandering in de opening diameter. Indien gewenst kan dit protocol worden gebruikt om de pipetten te maken met sub-micron openingen en weerstanden tussen de 5-10MΩ.

Discussion

We oorspronkelijk ontwikkelde deze methode om pipetten nuttig voor patch-clamp opnamen 2-3 um neuronen in C. elegans ^1. Het is in routine gebruik in het laboratorium Goodman. Wij druk polijsten pipetten niet alleen voor het opnemen van de kleine C. elegans neuronen, maar ook voor het verkrijgen van macropatch en single-channel opnames van ionenkanalen, uitgedrukt in Xenopus oöcyten. Voor een gegeven tip-opening met een diameter, de stompe vorm zorgt voor een lagere weerstand pipet. Lagere pipet weerstand leidt tot lagere serie weerstand en een lager geluidsniveau opnames.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Glass Capillaries	Consumable	Sutter Instrument Co.	BF150-85-10 (or similar)	The method works with any type of capillary except those made from quartz. However, we recommend using capillaries with a filament.
Inverted Microscope	Microscope	Leica Microsystems	DM IL (or similar)	Any simple inverted microscope will do. However, it is essential to have sufficient magnification to see pipettes during polishing. We use a 100x metallurgical lens with a long working distance for this purpose.
Microforge Kit	Tool	ALA Science	CPM-2	Supplies polishing coil, controller and foot pedal.
Air pressure source	Tool	ALA Science	PR-60	Accessory for providing high pressure, includes a suitable valve. Alternatively, compressed air from the building can be used together with a filter/regulator (set to 40 PSI) and a 4-way valve (see below)
4-way valve	Tool	Cole-Parmer	A-98150-01	Fittings will be needed to couple valve to tubing
Pipette Holder with Luer Connector	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH-6S20	Use a male luer-to-barb fitting to connect pipette holder to high-pressure tubing
Tygon® tubing	Tool	Cole-Parmer	06408-62	Use this tubing to connect pipette holder to 4-way valve