Name: Ein In-vitro- Modell zur Messung der Immunantwort auf Malaria im Kontext der HIV-Koinfektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Erfahren Sie, wie die angeborene Immunantwort auf Malaria bei chronischer HIV-Infektion untersucht wird. Diese Methode nutzt PBMC-Kokulturen mit Plasmodium falciparum und Flusszytometrie zur Zytokinanalyse.

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C.A.M.F. und L.S. beteiligten sich an der Protokollgestaltung, der Datenerfassung und -analyse sowie an der Erstellung des Artikels. 
Die Autoren danken Dr. Kain, Dr. Loutfy, Dr. Wasmuth und Dr. Ayi für ihre Beiträge.
C.F. wurde durch ein Postdoktorandenstipendium des CTN/Ontario HIV Treatment Network (OHTN) unterstützt. L.S. wird durch einen OHTN Junior Investigator Development Award unterstützt. Die vorliegende Arbeit wurde durch einen Betriebszuschuss der Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (MOP-13721 und 115160) und einen CIHR New Investigator Catalyst Zuschuss unterstützt.

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Unser Protokoll wurde entwickelt, um HIV-Malaria-Koinfektion meisten realistisch studieren in vitro optimiert. Zunächst werden frische menschliche Erythrozyten und Serum für die Malaria-Parasiten Kultur erforderlich. Dies ist entscheidend, um eine gesunde Population von Malaria-Parasiten zu erhalten. Parasite Lysaten kann nicht für Live-Parasiten substituiert sein, wie Zytokin-Produktion viel schneller und intensiver bei der Verwendung von Live-P. falciparum infizierten RBC (PfRBC) 17,18. Zu...

Co-Infektion, Infektion mit mehreren gleichzeitigen Infektionen, ist die Norm in natürlichen Umgebungen. Co-Infektion kann einen großen Einfluss auf die Krankheitspathologie und der klinischen Behandlung von jeder Infektion. Im Zusammenhang mit der Ko-Infektion, Impfstoff und Wirksamkeit von Medikamenten sowie diagnostische Tests können negativ beeinflusst werden (Übersicht in 1). Trotz ihrer Bedeutung ist die Mehrheit der Erreger der Forschung ist jedoch der Auffassung nur einzelne Infektionen. Malaria und HIV-1 (HIV) sind die führenden Ursachen von Morbidität und Mortalität weltweit. Bereiche von Malaria und HIV Endemizität teilen eine breite geografische Überschneidungen, indem Millionen von Menschen, die von Co-Infektion und somit ein Risiko für schwerere klinische Erkrankung 2-10. Die beiden Krankheiten negativ interagieren. In HIV-infizierten Personen, höhere HIV-Viruslast und vorübergehende Abnahmen der CD4 + T-Zellzahlen während einer Malaria-Infektion zu sehen, währendMalariaparasiten Lasten und Risiko von klinischen und schwerer Malaria sind in co-infizierten Personen 2,3,5,7,8,10 höher. Die Mechanismen, durch die HIV erhöht Malaria Schweregrad sind nicht vollständig verstanden und rechtfertigen weitere Untersuchungen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, mit dem Malaria und HIV-Koinfektion kann in vitro untersucht werden. Insbesondere ermöglicht dieses Verfahren für die Untersuchung von Malaria-spezifischen Immunantworten im Zusammenhang mit HIV-Infektion. Unser Protokoll beschreibt ein vielseitiges Kokultursystem frisch isolierten peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von chronisch HIV-infizierten Spendern und in vitro kultivierten P. isoliert falciparum parasitierten Erythrozyten (PfRBC). Die Auswirkungen von HIV antiretroviralen Therapie auf diesen Reaktionen können auch unter Verwendung prospektiv erfasst PBMCs von HIV (+) Spender vor und nach der Behandlung untersucht werden. Hat dieses System verwendet, um den Einfluss der HIV-Infektion zu untersuchenMalaria-spezifischen angeborenen Immunantwort 11,12 und waren in der Lage, um festzustellen, dass die Malaria-spezifische IFNy und TNF-Antworten werden in NK-Zellen beeinträchtigt, NKT-Zellen, γδ T-Zellen von HIV (+) Spender vor und nach der HIV antiretroviralen Therapie . Darüber hinaus konnten wir dieses System verwenden, um festzustellen, dass Monozyten-Funktionen werden auch in HIV (+) Spendern beeinträchtigt, aber erholen post HIV antiretroviralen Therapie.

<table><tbody><tr><td>Alanin</td><td>Sigma</td><td>A7377</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper (siehe andere Tabelle)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm mit BD GolgiPlug</td><td>BD</td><td>555028</td><td>enthält Brefeldin A, Cytofix/Cytoperm Puffer und Perm/Wash Puffer</td></tr><tr><td>BD Vacutainer ACD Solution A</td><td>BD</td><td>364506</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Natriumheparin</td><td>BD</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (kein Calcium, kein Magnesium)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum</td><td>Sigma</td><td>F1051</td><td>vor Gebrauch hitzeinaktiviert</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin (10 mg/ml)</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Hema3 Färbeset</td><td>Fisher</td><td>122-911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxanthin</td><td>Sigma</td><td>H9636</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma</td><td>I3909</td><td></td></tr><tr><td>MEM nicht-essentielle Aminosäuren (10 mM)</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Pulver</td><td>Life-Technologies</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 mit L-Glutamin und HEPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30255.01</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat (Pulver, Zellkultur)</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Tris (Trizma Base)</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Ambion</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>BD CompBead</td><td>BD</td><td>552843, 552845</td><td>hängt von den verwendeten Antikörpern</td></tr> ab <tr><td>Parasitengasgemisch</td> Auf <td>Sonderbestellung</td><td></td><td>3% CO2, 1% O2, Saldo N2</sub</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 &#956; m Filtereinheit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T25 Kolben</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75 Kolben</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 Well Kulturplatten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>unplugged Pasteur Pipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>verstopft Pasteur Pipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr> sterile <tr><td>Transferpipetten Hämozytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometer (3 Laser)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><stark>Antikörper für die Durchflusszytometrie</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-TNF</td><td>eBiosciences</td><td>551487</td><td>FITC (Fluorophor)
2 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-IFN&#947;</td><td>Biolegend</td><td>506507</td><td>PE (Fluorophor) 
20 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-CD8</td><td>Biolegend</td><td>300914</td><td>PE-Cy7 (Fluorophor) 
1 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-CD14-Biolegende</td><td>; BD Biosciences</td><td>325624; 551487</td><td>Biotin (Fluorophor) 
0,5 &#956; l
Streptavin PE-TR (Fluorophor) 
0,1 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-CD56</td><td>Biolegend</td><td>318322</td><td>PerCP/Cy5.5 (Fluorophor) 
5 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-&#947; &#948;</td><td>Biolegend</td><td>331212</td><td>APC (Fluorophor)
5 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-CD3</td><td>Biolegend</td><td>300426</td><td>APC-Cy7 (Fluorophor) 
5 &#956; l</td></tr><tr><td>Anti-CD4</td><td>Biolegend</td><td>317424</td><td>Pacific Blue (Fluorophor)
1 &#956; l</td></tr></tbody></table>

ein<em&gt; in-vitro-</em&gt; modell zur messung der immunantwort auf malaria im kontext der hiv-koinfektion

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria und HIV-Koinfektionen sind eine wachsende Gesundheitspriorität. Die meisten Forschungen zu Malaria oder HIV konzentrieren sich derzeit jedoch auf jede einzelne Infektion. Obwohl es wichtig ist, die Krankheitsdynamik für jeden dieser Erreger unabhängig voneinander zu verstehen, ist es auch wichtig, dass die Wechselwirkungen zwischen diesen Erregern untersucht und verstanden werden. 
Wir haben ein vielseitiges in vitro Modell der HIV-Malaria-Koinfektion entwickelt, um die Immunantworten des Wirts auf Malaria im Kontext einer HIV-Infektion zu untersuchen. Unser Modell ermöglicht die Untersuchung von sezernierten Faktoren in zellulären Überständen, Zelloberflächen- und intrazellulären Proteinmarkern sowie RNA-Expressionsniveaus. Das Versuchsdesign und die verwendeten Methoden begrenzen die Variabilität und fördern die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Daten. 
Alle Krankheitserreger, die in diesem Modell verwendet werden, sind natürliche menschliche Krankheitserreger (Plasmodium falciparum und HIV-1), und alle infizierten Zellen werden auf natürliche Weise infiziert und frisch verwendet. Wir verwenden humane Erythrozyten, die mit P. falciparum parasitiert und in kontinuierlicher In-vitro-Kultur gehalten werden. Wir gewinnen frisch isolierte mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut von chronisch HIV-infizierten Freiwilligen. Für jede verwendete Erkrankung gibt es eine geeignete Kontrolle (P. falciparum parasitiert vs. normale Erythrozyten), und jeder HIV-infizierte Spender hat eine HIV-nicht infizierte Kontrolle, von der die Zellen am selben Tag entnommen werden. Dieses Modell bietet eine realistische Umgebung, um die Wechselwirkungen zwischen Malariaparasiten und menschlichen Immunzellen im Rahmen einer HIV-Infektion zu untersuchen.

Die Graphen zeigen die Niveaus der IFN &amp; ggr; Produktion von NKT-Zellen (Figur 2), mit CD56 + CD3 + γδ- Toren der NKT Zellen Population zu erhalten (Daten nicht gezeigt). Die Zellen wurden für 72 Stunden vor der Färbung kultiviert. Sobald befleckt, 100.000 CD3 + Zellen wurden auf die Strömung erfasst Zytometer zu groß genug Populationen von NK, NKT und γδ-Zellen (Zellen von Interesse) zu erhalten. Ein Minimum von 5600 NKT-Zellen sind auf jedem Graphen angezeigt. TNF-Produktion wird in der gleichen A...

Koinfektion beim Menschen ist in vitro schwer zu replizieren. Humane Malariaparasiten können jedoch problemlos in vitro kultiviert werden, ebenso wie frisch isolierte mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut, die auf natürliche Weise mit HIV infiziert sind. Dies stellt ein hervorragendes Modell dar, um frühe Immunantworten auf Malariaparasiten im Rahmen einer HIV-Koinfektion zu untersuchen.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Messung der Immunantwort auf Malaria im Kontext der HIV-Koinfektion

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die angeborene Immunantwort auf Malaria unter Bedingungen einer chronischen HIV-Infektion zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem in einem ersten Schritt lebende Plasmodium falciparum-Parasiten in menschlichen roten Blutkörperchen kultiviert werden, und in einem zweiten Schritt periphere mononukleäre Blutzellen, die von HIV-positiven und nicht infizierten Spendern stammen, mit den malaria-Parasiten-infizierten roten Blutkörperchen koinkubiert werden.Schließlich wird die Durchflusszytometrie verwendet, um die Zytokinaktivität der angeborenen Immunzellen von Menschen mit HIV-Infektion im Vergleich zu nicht infizierten Kontrollpersonen zu bewerten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich von Ko-Infektionen zu klären. Zum Beispiel: Welche Auswirkungen hat das Vorhandensein einer Infektion wie HIV auf die Immunantwort gegen eine zweite Infektion wie Malaria? Um die Parasiten zu synchronisieren, zentrifugieren Sie die Parasitenkultur und lysieren Sie die Trophozoiten-Stadium-Parasiten im Pellet mit 19 Volumina Alaninlösung bei 37 Grad Celsius bei Raumtemperatur. Nach 15 Minuten zentrifugieren Sie die Zellen z

an-vitro-model-for-measuring-immune-responses-to-malaria-context-hiv

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Infektion Modell zum Studium<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; HIV-1-Wechselwirkungen in primären menschlichen Monozyten abgeleitete Immunzellen

Dieses Video zeigt die ex vivo-Infektion von menschlichem Gebärmutterschleimhautgewebe mit dem humanen Immundefizienzvirus Typ 1, HIV-1, und deren Aufrechterhaltung auf Gelatineschwämmen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche. Diese Methode ermöglicht die Überwachung der HIV-1-Replikation und Pathogenese im menschlichen Gewebe.

Ein humanes Zervixschleimhautinfektionsmodell zur Untersuchung der HIV-Pathogenese unter ex vivo-Bedingungen

Dieses Video zeigt die Generierung eines in vitro Malaria-HIV-Koinfektions-Zellkulturmodells. HIV-infizierte mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut, die mit Plasmodium falciparum-parasitierten Erythrozyten co-kultiviert werden, unterstützen möglicherweise das Wachstum der anderen und geben Einblicke in die Immunantworten und den Krankheitsverlauf bei HIV- und Malaria-Koinfektionen.

Generierung eines in vitro Zellkulturmodells für Malaria-HIV-Koinfektionen

Wir entwickelten ein in vitro Assay, um die Rolle von immunWege in der Regulation der Zytokin-Sekretion von HIV-spezifischen CD4 + T-Zellen zu untersuchen.

In vitro-Test, um die Auswirkungen von immun Pathways auf die HIV-spezifischen CD4 T-Zell-Effektor-Funktion auswerten

Tuberkulose und Malaria sind zwei der häufigsten Infektionen bei Menschen und die Hauptursachen für Morbidität und Mortalität bei der verarmten Bevölkerung in den Tropen. Wir gründeten eine experimentelle Modellsystem, um Ergebnisse der Malaria-Tuberkulose-Koinfektion bei Mäusen nach der Infektion mit beiden Erregern über ihre natürlichen Infektionsweg zu studieren.

Eine experimentelle Modell zum Studium Tuberkulose-Koinfektion auf Natur Malaria Übertragung von Mycobacterium tuberculosis Und Plasmodium berghei</i

Anders als zellfreie HIV-1-Partikeln infiziert sind CD4 + -T-Zellen wirksam durch plasmacytoid dendritischen Zellen (pDC) abgetastet. Diese Handschrift beschreibt ein Verfahren, bei peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) oder isolierten pDCs co-kultiviert, das mit HIV-1 infizierte T-Zellen, um angeborene Erfassung durch pDCs bewerten, wie durch Freisetzung von Typ-I-IFN beurteilt.

Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Co-Kultursystem.

Die Malaria-Parasiten dringt und Wiederholungen in den roten Blutkörperchen. Die genaue Beurteilung der Merozoiten Invasion und Parasitämie ist daher entscheidend für die Beurteilung der Verlauf der Malaria-Infektion. Hier beschreiben wir eine Durchflusszytometrie basiertes Protokoll für die Messung dieser Parameter in einem Maus-Modell der Malaria.

In-vivo-Bewertung der Nager Plasmodium Parasitämie und Merozoite Invasion durch Durchflusszytometrie

Dieses Protokoll beschreibt die Methoden zur Konstruktion eines humanisierten Knochenmark-/Leber-/Thymus-Mausmodells mit stammzellbasierter künstlicher Immunität gegen HIV-Infektionen.

Stammzellen Basierend Engineered Immunität gegen HIV-Infektion in der humanisierten Maus-Modell

Wir beschreiben ein Mausmodell der experimentellen zerebralen Malaria und zeigen, wie entzündliche und mikrovaskuläre Pathologien in vivo mit Hilfe der Magnetresonanztomographie verfolgt werden können.

In vivo Verfolgung von Ödementwicklung und mikrovaskulärer Pathologie in einem Modell der experimentellen zerebralen Malaria mit Magnetresonanztomographie

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Anweisungen zu geben, wie die Kapazität von Antikörpern gemessen werden kann, die in Seren oder Plasma von Individuen vorhanden sind, die natürlich einer Plasmodium falciparum-Infektion ausgesetzt sind, um die Phagozytose der parasiteninfizierten Erythrozyten (IEs) zu opsonisieren und zu induzieren.

Messung natürlich erworbener Phagozytose-induzierender Antikörper gegen Plasmodium falciparum Parasiten durch einen Flow Cytometry-based Assay

Hier beschreiben wir eine neue Methode, um die Mechanismen der zellulären Immunität gegen Plasmodien während der Blutphase der Infektion aufzuklären. Dabei handelt es sich um einen In-vitro-Assay , der die Abtötung infizierter roter Blutkörperchen durch zytotoxische Lymphozyten misst.

In vitro Untersuchung der Abtötung von Plasmodium-infizierten roten Blutkörperchen durch zytotoxische Lymphozyten

Erfahren Sie, wie die angeborene Immunantwort auf Malaria bei chronischer HIV-Infektion untersucht wird. Diese Methode nutzt PBMC-Kokulturen mit Plasmodium falciparum und Flusszytometrie zur Zytokinanalyse.

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