Ein In-vitro- Modell zur Messung der Immunantwort auf Malaria im Kontext der HIV-Koinfektion

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die angeborene Immunantwort auf Malaria in einer chronischen HIV-Infektion zu beobachten. Dies wird erreicht, indem zunächst lebende P-False-Parum-Parasiten in menschlichen roten Blutkörperchen kultiviert werden, während in einem zweiten Schritt mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut kultiviert werden, die von HIV-positiven und nicht infizierten Zellen stammen. Die Spender werden mit dem Malariaparasiten infizierten roten Blutkörperchen co-kultiviert.

Letztendlich wird die durchflusszytometrische Analyse verwendet, um die Zytokinaktivität der angeborenen Immunzellen von Menschen mit HIV im Vergleich zu der von nicht infizierten Kontrollen zu beurteilen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Koinfektion zu beantworten. Zum Beispiel, was wirkt sich das Vorhandensein einer Infektion wie HIV auf die Immunantwort einer zweiten Infektion wie Malaria aus? Um die Parasiten zu synchronisieren, schleudern Sie die Parasitenkultur herunter und lyzieren Sie die Trophozoiten Stadium Parasiten im Pellet mit 19 Volumina 37 Grad Celsius Alaninlösung bei Raumtemperatur Nach 15 Minuten schleudern Sie die Zellen in RPMI Null zweimal herunter.

Einstellen des Hämatokrits auf 3% in R-P-M-I-A nach der zweiten Wäsche. Begasen Sie dann den Kolben und stellen Sie ihn wieder in den 37-Grad-Inkubator, bis die Trophozoiten einen Parsit von fünf bis 10 % erreichen, um den Parsit der Probe zu berechnen. Geben Sie eine 10-Mikroliter-Probe aus der Blutschicht auf einen Objektträger und verwenden Sie einen zweiten Objektträger, um einen dünnen Film des Blutes zu erzeugen, nachdem das Blut getrocknet ist.

Färben Sie den Objektträger mit einem HEMA-Färbekit mit drei Färbeeinheiten gemäß dem Protokoll des Herstellers. Zur Berechnung der Gesamtzahl der infizierten roten Blutkörperchen. Zählen Sie 300 Zellen mit dem Lichtmikroskop und vergleichen Sie die Anzahl der dunkelviolett gefärbten parasitierten Erythrozyten mit der Anzahl der hellrosa nicht infizierten Zellen, um den Hämatokrit zu bestimmen.

Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Anzahl der roten Blutkörperchen pro Milliliter Parasitenkultur zu bestimmen. Schleudern Sie dann die Parasitenkultur wieder herunter und resuspendieren Sie die Zellen bei sechsmal 10 zu den sechs parasitierten Erythrozyten pro Milliliter in R-P-M-I-S plus, um die humanen PBMC-verdünnten Blutproben zu isolieren, die von HIV-positiven oder HIV-negativen Spendern in einem gleichen Volumen an kaltem DPBS gewonnen wurden. Anschließend bei 15 Millilitern Raumtemperatur Fial in jeweils ein 50 Milliliter Röhrchen geben.

25 Milliliter DPBS-Lösung aus dem Blut, gefolgt von einer sorgfältigen Schichtung von bis zu 25 Millilitern des Blutes und der DPBS-Lösung. Trennen Sie die Zellen mit einer sterilen Kunststoff-Transferpipette durch Zentrifugation und verwenden Sie dann eine sterile Kunststoff-Transferpipette, um das PBMC von der Grenzfläche zu sammeln. Übertragen Sie bis zu 20 Milliliter Aliquots des PBMC in einzelne 50 Milliliter Röhrchen.

Bringen Sie dann das Gesamtvolumen jedes Röhrchens mit sterilem Kalt-DPBS auf bis zu 50 Milliliter. Schleudern Sie nun die Zellen wieder herunter und suspendieren Sie das Pellet in 50 Millilitern frischem sterilem DPBS für zwei weitere Wäschen nach der letzten Wäsche. Reus suspendiert die Zellen in 10 Millilitern R-P-M-I-S plus zum Zählen und stellt dann das PBMC auf eine Endkonzentration von 10 mal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter in R-P-M-I-S plus ein, um die Co-Infektion einzurichten.

Die Kulturen beginnen mit der Aussaat von eins mal 10 bis sechs frisch isolierten HIV-positiven und HIV-negativen PBMC in 100 Mikrolitern R-P-M-I-S plus pro Vertiefung in eine 24-Well-Platte. Bringen Sie das Gesamtvolumen jeder Vertiefung auf 500 Mikroliter mit 400 Mikrolitern R-P-M-I-S plus dann in dreifacher Ausfertigung und in einem Gesamtvolumen von 500 Mikrolitern pro Vertiefung bei dreimal 10 der sechs nicht infizierten roten Blutkörperchen oder dreimal 10 der sechs parasitierten roten Blutkörperchen zu den HIV-infizierten und HIV-nicht infizierten Zellen. Legen Sie die Co-Infektionsplatte in einen Zellkultur-Inkubator.

Pelletieren Sie dann nach dem entsprechenden Versuchszeitraum die Zellen und sammeln Sie 700 Mikroliter Kulturüberstand von jedem. Nun, zentrifugieren Sie den Überstand, um alle Rückstände zu entfernen, und aliquotieren Sie die Proben nach Bedarf. Beschriften Sie die Röhrchen und frieren Sie sie für die spätere Analyse bei minus 20 Grad Celsius oder darunter ein.

Sechs bis acht Stunden vor der Analyse der zellspezifischen Zytokinproduktion. Behandeln Sie die Proben mit einem Mikroliter 1000 dpt pro Felden, a pro Vertiefung am Ende der Inkubation. Den Teller für 15 Minuten auf Eis legen.

Verwenden Sie dann eine sterile Pipette, um die Zellen vom Boden der Platte zu entfernen und in beschriftete Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen. Schleudern Sie nun die Zellen herunter und resuspendieren Sie die Pellets in 500 Mikrolitern Durchflusszytometrie-Puffer. Teilen Sie die Zellen so auf, dass jede Probe mindestens ein Röhrchen für die vollständige Antikörperfärbung enthält.

Ein Röhrchen für die Fluoreszenz- minus eine Kontroll-Antikörperfärbung umfasst auch eine einzelne ungefärbte Durchflusszytometrie-Kontrolle. Markieren Sie dann die vollständige Antikörperfärbung und die Fluoreszenz minus eine Kontrollzelle in 50 Mikrolitern Durchflusszytometrie-Puffer mit einer vortitrierten Fluorkonzentration. Vier konjugierte Antikörper gegen die gewünschten Zelloberflächenmarker bei vier Grad Celsius und nach 20 Minuten lichtgeschützt.

Waschen Sie die Proben in einem Milliliter Durchflusszytometrie-Puffer und bei 100 Mikrolitern cyto fixierter Cyto-Perm-Lösung in jedes Röhrchen. Nach 20 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln waschen Sie die Zellen in einem Milliliter Permeationswaschpuffer, schleudern Sie die Zellen herunter und suspendieren Sie die Pellets wieder in 100 Mikrolitern Permeationswaschpuffer, wobei Sie eine vortitrierte Konzentration von Fluor-4-konjugierten Antikörpern zu den gewünschten intrazellulären Markern hinzufügen, die für die vollständigen Antikörper von Interesse sind. Färben von Proben.

Inkubieren Sie alle Röhrchen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius vor Licht geschützt. Waschen Sie dann die Proben in einem Milliliter Permeationswaschpuffer pro Röhrchen. Fixieren Sie schließlich die Pellets 15 Minuten lang in 300 Mikrolitern Puffer mit niedrigem Zytometriegehalt, ergänzt mit 1 % Paraformaldehyd, um das HIV zu neutralisieren, bevor Sie sie durch Durchflusszytometrie analysieren. In diesen Diagrammen werden die Werte der Interferon-Gamma-Produktion von natürlichen Killer-T-Zellen bei HIV-positiven und HIV-negativen Personen gezeigt, die parasitierten roten Blutkörperchen ausgesetzt waren oder nicht infizierte rote Blutkörperchen kontrollieren.

Beachten Sie, dass die unterdrückte angeborene Immunantwort auf eine malale Infektion, die bei HIV-positiven PBMC beobachtet wurde, was sich in ihrer fehlenden Interferon-Gamma-Produktion in Gegenwart der parasitierten roten Blutkörperchen zeigt, im Vergleich zu der robusten Zytokinproduktion, die PBMC von HIV-negativen Personen zeigt. Vergessen Sie also nicht, dass die Arbeit mit HIV extrem gefährlich ist und Vorsichtsmaßnahmen wie das Durchführen aller Schritte in einer Biosicherheitswerkbank der Stufe zwei, das Tragen der entsprechenden Sicherheitsausrüstung und das Vermeiden der Verwendung von glasscharfen Gegenständen und einem Aspirator während der Durchführung dieser Protokolle getroffen werden sollten.