Fabricage van Amperometrisch Elektroden
Summary
Dit protocol beschrijft hoe het genereren van carbon fiber elektroden. De elektroden worden vervolgens gebruikt om de catecholamine vrijlating detecteren van blaasjes met koolstofvezel amperometrie.
Abstract
Carbon fiber elektroden zijn cruciaal voor de detectie van catecholamine vrijlating uit de blaasjes in enkele cellen voor amperometrie metingen. Hier beschrijven we de technieken die nodig zijn om een laag geluidsniveau (<0,5 pA) elektroden te genereren. De technieken zijn aangepast op basis van gepubliceerde beschrijvingen van eerdere onderzoekers (1,2). Elektroden worden gemaakt door het bereiden van koolstofvezels en threading ze individueel in elke capillair met behulp van een vacuüm met een filter om de vezels zuigen. Vervolgens wordt de capillaire buis met glasvezel getrokken door een trekker elektrode, het creëren van twee helften, elk met een fijne puntige tip. De elektroden zijn gedrenkt in hete, vloeibare epoxy gemengd met verharder aan een epoxy-glazen afdichting te creëren. Ten slotte worden de elektroden in een oven geplaatst om de epoxy te genezen. Zorgvuldige behandeling van de elektroden is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat ze gemaakt zijn consequent en zonder schade. Dit protocol laat zien hoe om te fabriceren en amperometrische elektroden geknipt voor de opname van enkelvoudige cellen.
Protocol
Discussion
Dit protocol beschrijft hoe te genereren en te snijden amperometrische elektroden. Tijdens de amperometrische opnames, is een carbon fiber elektrode geplaatst tegen het oppervlak van een secretorische cel. Exocytotic activiteit wordt waargenomen als amperometrische spikes, die de elektrochemische stroom veroorzaakt door de overdracht van elektronen na oxidatie van de catecholamines aangeeft. Met de praktijk maken en snijden amperometrische elektroden, kan het geluidsniveau sterk worden verbeterd ten opzichte van veel va…
Acknowledgements
Wij danken dr. Aaron P. Fox aan de universiteit van Chicago, in wiens laboratorium dit protocol oorspronkelijk werd ontworpen, en William Roden (Saint Louis University) voor de verdere ontwikkeling van het protocol.
Met dank aan de Whitehall Foundation en National Science Foundation voor ondersteuning.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Epoxy Hardener 1,3-phenylene-diamene flakes | Reagent | Sigma Aldrich | P23954-100G04 716AJ | Aliquots are stored in a dessicator and should not be exposed to light. |
| Carbon Fibers | Material | Goodfellow | C005725 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Material | Fisher | NC9836768 | |
| Epoxy Resin | Reagent | Miller-Stephenson | Epon Resin 828 | |
| Dissecting Microscope | Instrument | |||
| Electrode Puller | Instrument | Narishige Japan | PP-830 | 1st pull = 24.8 degrees C; 2nd pull = 62.7 degrees C |
| Oven | Instrument | set to 100 degrees F. | ||
| Hot plate | Instrument | set to 55 degrees C |
Referenzen
- Mundorf, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Curr Protocols in Neurosci. 6 (14), 1-6 (2002).
- Machado, D. J., Montesinos, M. S., Borges, R. Good practices in single-cell amperometry. Methods in Molec. Biol. 440, 297-313 (2008).
