إعداد Aplysia الحسية والحركية الثقافات الخلية متعلق بالخلايا العصبية
Summary
الابتدائي ثقافات<em> Aplysia</em> الحسية والحركية العصبية توفير إعداد نموذج لدراسة تشكيل المشبك واللدونة متشابك<em> في المختبر</em>. هذا الفيديو يوضح تحديد وmicrodissection من الخلايا العصبية الحسية والحركية من<em> Aplysia</em> العقد فضلا عن أساليب لإنشاء وصيانة الخلايا العصبية الحسية والحركية في الثقافة.
Abstract
الجهاز العصبي للcalifornica الرخوي البحري Aplysia بسيط نسبيا ، ويتألف من حوالي 20،000 الخلايا العصبية. الخلايا العصبية هي كبيرة (تصل إلى 1 مم في القطر) ومحددة ، ذات أحجام مختلفة ، والأشكال والمواقف وتصبغات ، وتتعرض خارجيا الهيئات خلية في العقد المقترنة five موزعة في جميع أنحاء الجسم من الحيوان. وقد سمحت هذه الخصائص المحققين لتحديد الدوائر الكامنة وراء السلوكيات محددة في هذا الحيوان 1. الاتصال الأحادي المشبك بين الخلايا العصبية الحسية والحركية هي المكون المركزي للمنعكس الخيشومية الانسحاب في الحيوان ، ومنعكس بسيطة الدفاعية التي انسحبت الحيوان الخيشومية في تحفيز استجابة لمسية للسيفون. هذا المنعكس يخضع لأشكال التعلم غير النقابي والجمعياتي ، بما في ذلك التوعية والتعود وتكييف الكلاسيكية. من فائدة خاصة لدراسة اللدونة متشابك ، ويمكن إعادة تشكيل المشبك الحسية والحركية في الثقافة ، حيث تتميز جيدا المحفزات انتزاع أشكال اللدونة التي يرتبط مباشرة في سلوك الحيوان 2،3. على وجه التحديد ، وتطبيق السيروتونين تنتج تعزيز متشابك ذلك ، اعتمادا على بروتوكول التطبيق ، ويستمر لمدة دقيقة (على المدى القصير التيسير) ، وساعات (متوسطة الأجل التيسير) أو أيام (على المدى الطويل التيسير). في المقابل ، تطبيق FMRFamide الارسال الببتيد تنتج ضعف أو الاكتئاب التي متشابك ، اعتمادا على بروتوكول التطبيق ، ويمكن أن تستمر من دقائق إلى أيام (على المدى الطويل والاكتئاب). حجم كبير من الخلايا العصبية يسمح للتسجيل الكهربائي المتكرر للقوة متشابك حادة على مدى فترات من الأيام مع microinjection ناقلات التعبير ، siRNAs ومركبات أخرى لهدف محدد يشير الى شلالات والجزيئات وبالتالي تحديد الخطوات الجزيئية والخلايا البيولوجية التي تكمن وراء التغيرات في فعالية متشابك.
ميزة إضافية للنظام الثقافة Aplysia يأتي من حقيقة أن الخلايا العصبية المشبك ، شرح خصوصية 4،5 في الثقافة. وهكذا ، الخلايا العصبية الحسية لا تشكل نقاط الاشتباك العصبي مع أنفسهم (autapses) أو مع غيرها من الخلايا العصبية الحسية ، كما أنها لا تشكل نقاط الاشتباك العصبي مع غير المستهدفة الخلايا العصبية الحركية التي تم تحديدها في الثقافة. ودوالي ، ومواقع للاتصال متشابك بين الخلايا العصبية الحسية والحركية ، وكبيرة بما فيه الكفاية (2-7 ميكرون في القطر) للسماح درس تشكيل المشبك (فضلا عن التغييرات في مورفولوجية متشابك) مع الخلايا العصبية الحركية الهدف على المستوى المجهري الخفيفة.
في هذا الفيديو ، ونظهر كل خطوة من إعداد الثقافات الخلايا العصبية الحسية والحركية ، بما في ذلك الكبار والتخدير Aplysia الأحداث ، وتشريح العقد بهم ، والهضم البروتيني من العقد ، وإزالة النسيج الضام التي microdissection ، وتحديد كل من الخلايا العصبية الحسية والحركية ، وإزالة لكل نوع من الخلايا التي microdissection ، والطلاء من الخلايا العصبية الحركية ، بالإضافة إلى ذلك من الخلايا العصبية الحسية والتلاعب neurite الحسية إلى شكل من أشكال الاتصال مع الخلايا العصبية الحركية مثقف.
Protocol
Discussion
الإعداد الناجح للثقافات الحسية والحركية وAplysia منحنى التعلم بطيئة نوعا ما ، لأنه ينطوي على تنمية المهارات الحركية الدقيقة المرتبطة microdissection والتلاعب في الخلايا العصبية الفردية ينظر من خلال المجهر ستيريو. في تجربتنا ، فإنه يأخذ 1-3 أسابيع تقريبا من الممارسة للحصو?…
Acknowledgements
ويتم تمويل عمل في المختبر التي تنطوي على زراعة الخلايا العصبية التي Aplysia قائمة المعاهد الوطنية للصحة NIH R01 وR21MH077921.
Materials
Solutions needed for culture
- 0.35 M MgCl2, stored at room temperature, used for anesthesia.
- Poly-L-lysine solution, Sigma: P-1524, MW >300,000, made in 0.1M Sodium Borate pH8.2 to 0.5mg/ml solution. Vortex well and filter sterilize through a 0.22 μm filter, store it at 4C°. Do not freeze-thaw.
- L-15 Medium powder (Leibovitz) (Sigma: L4386) supplemented with the salts as below to make 1 liter
Add ddH20 to 1 liter. The pH should be about 7.4-7.5, add 10ml of 100X Pen/Strep solution, and filter-sterilize through a 0.22 µm filter. Store at 4C0 for no longer than 1 month.L-15 powder 13.8g NaCl 15.4 g D-Glucose 6.24 g MgSO4•7H20 6.45g KCl 350 mg NaHCO3 170 mg MgCl2•6H2O 5.49 g CaCl2•2H2O 1.43g HEPES 3.53g - Protease digestion solution: 1% Protease IX (1unit/mg) is made in L15 (supplemented with salts as above) or in ASW immediately before use, filter-sterilized through a 0.22 µm Millipore. 5mls should be enough for the ganglia from two animals (make sure the ganglia are completely immersed in protease solution). Sigma has reported that they will discontinue selling Protease IX. A substitute protease is: Dispase II (Roche Applied Science catalog # 04942078001).
- Culture medium. Immediately prior to preparing cultures, thaw a 10 ml aliquot of hemolymph and mix it with 10 mls of L15 (supplemented with salts as above) to make 20mls culture medium. Add 200 μl of 200mM L- Glutamine, mix well and use for preparing cultures. This medium should be prepared fresh each time cultures are made.
- Artificial Seawater can be made from Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) or as follows: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl2(6H2O), 20 mM MgSO4, 10 mM CaCl2(2H2O), 10 mM HEPES, with pH adjusted to 7.4.
Referenzen
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Rayport, S. G., Schacher, S. Synaptic plasticity in vitro: cell culture of identified Aplysia neurons mediating short-term habituation and sensitization. J Neurosci. 6 (3), 759-763 (1986).
- Goldberg, D. J., Schacher, S., Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , 213-236 (1998).
- Glanzman, D. L., Kandel, E. R., Schacher, S. Identified target motor neuron regulates neurite outgrowth and synapse formation of aplysia sensory neurons in vitro. Neuron. 3 (4), 441-450 (1989).
- Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons. Neuron. 49 (3), 349-356 (2006).
- Martin, K. C., Casadio, A., Zhu, H. Synapse-specific, long-term facilitation of aplysia sensory to motor synapses: a function for local protein synthesis in memory storage. Cell. 91 (7), 927-938 (1997).
- Guan, Z., Giustetto, M., Lomvardas, S. Integration of long-term-memory-related synaptic plasticity involves bidirectional regulation of gene expression and chromatin structure. Cell. 111 (4), 483-493 (2002).
