ルシフェラーゼ免疫系による抗体のプロファイリング（LIPS）

Summary

実行LIPS（ルシフェラーゼ免疫システム）の技術的な側面が説明されています。全体的なアプローチは、哺乳動物細胞でウミシイタケルシフェラーゼ（RUC）に融合した抗原をコードするキメラ遺伝子を発現する伴います。原油RUC -抗原の抽出液を調製し、精製することなく、抗体を定量化するために免疫沈降アッセイにおいて使用される。

Abstract

総合的に自己抗原と感染性病原体に対する抗体のプロファイルを理解し、定量化するための技術は、病気のメカニズムに新たな洞察をもたらすかもしれませんし、別の臨床的特徴と病因についての理解を深めるとともに病気をsubstratifyに新しいマーカーを明らかにすることがあります。我々は、感染症に関連する自己抗原と病原体抗原に対する患者血清の抗体応答をプロファイリングするためのルシフェラーゼ免疫システムを（LIPS）と呼ばれる高度に定量的な方法を開発した。 ELISA法とは異なり、高感度なLIPSは、簡単に普遍的な形式の異なる抗原に対する体液性血清学的応答プロファイルを調査するために実装し、動的な抗体価が6ログまで変化して生成され₁₀いくつかの抗原に対して。これらの研究では、抗原のパネルあるいはいくつかの病原体（すなわちHIV）の全体プロテオームに対する患者の体液性応答のLIPSによる定量的プロファイリングは、通常、ELISAによって単一の抗原をテストするより有益です。さらに、LIPSはまた高度に精製した抗原だけでなく、標準的なELISAのために必要な労働集約型のアッセイの最適化のステップを生成するために必要な時間と労力を排除。ここでは、容易に単一または複数の抗原に対する抗体応答をプロファイリングするための実行LIPSアッセイの技術的な側面を説明する詳細なプロトコルを提供しています。

Protocol

1。回路図の概要： このビデオでは、LIPSのアッセイを行うために必要な手順を示しています。抗原は、組換えウミシイタケルシフェラーゼ（RUC）-抗原の融合、および粗抽出物などのCOS1細胞で発現され得られ、精製せずに使用。 LIPSのアッセイは、マイクロタイターウェルの患者の血清を使用するCRUD 電子 RUC -抗原抽出物をインキュベートすることによって開始されます。抗体 – 抗原の混合物を、次いでIgG分子を捕捉するプロテインA / Gビーズを含む96ウェルフィルタープレートに移している。プロテインA / Gビーズを含むフィルタープレートを洗浄した後、RUC -抗原結合した抗体は、ルミノメーターで測定されるセレンテラジンの基板と光ユニットを添加することによって測定されます。 PART 1： シイタケ -抗原融合タンパク質の生産のためのプラスミドのトランスフェクション セットアップ：COS1細胞を標準組織培養のプロトコルを使用して、DMEM – 10％FCSで培養されています。 ウミシイタケルシフェラーゼ融合のためのプラスミドは、以前は1記載されている。これらのプラスミドのDNAはキアゲンからミディプレップキットを用いて調製される。収率は約1-3 mgのはずです。 -20℃で1000μg/ mlのストック溶液としてDNA濃度とストアを測定手順： トランスフェクション前日、分割されたCOS – 1 37新100への細胞プレートとインキュベート当たり約2 × 10 6時× 20 mmディッシュを℃に次の日に、COS – 1細胞​​は80から95パーセントコンフルエントにする必要があります。各プラスミドDNA用ラベル1.5mlのポリプロピレンマイクロチューブは、トランスフェクトされる。 4℃で保存されているトランスフェ- 6トランスフェクション試薬は、室温にウォームアップ。 各マイクロチューブにのOpti – MEMのメディアの94μlを添加する。次側の壁に触れることなくのOpti – MEM培地にFuGENE 6トランスの6μlを加える。 室温で5分間混合物をインキュベートする。 構築ウミシイタケルシフェラーゼ抗原の融合のためのプラスミドの1〜2μgのを（1mg/ml DNAのストックから）を追加します。混和し、次いで室温で15分間混合物をインキュベートする。 COS1細胞の培地に均等にそれを滴下して細胞にDNA – FuGENE 6トランスフェ – のOpti – MEMのソリューションを転送する。 PART 2：収穫シイタケ -抗原の融合トランスフェクションの2日後、COS – 1細胞​​を回収している。これは、メディアを削除してからPBSを6mlで細胞を洗浄することで開始されます。 PBSをデカントした後、組織培養皿から離れて任意の残留PBSをピペット。 50mMトリス、pH7.5の、100mMのNaCl、5 mMのMgCl 2、1％トリトンX – 100、50％グリセロールおよびプロテアーゼ阻害剤（50 mlあたりの完全miniprotease阻害剤のカクテルの2錠で構成される冷溶解緩衝液1.4 mlを加え溶解バッファー）。セルの解体作業員による収穫の細胞は、すぐに氷上に2つの1.5mlマイクロチューブの各々にライセートの半分を譲渡する。 ブランソン超音波処理150は、細胞が開いて分割するために使用されます。それぞれ、2,2および4の超音波処理の設定で5秒、5秒と5秒のための氷とパルスで細胞溶解液を含むマイクロ遠心チューブを置きます。 最初のスピンの後、軽くチューブの側壁から緩やかに添付された残骸を削除するためにチューブを逆さに4℃で2つの4分間のスピン℃、12,500 rpmで細胞ライセートを遠心。第二スピンした後、氷上に新しいマイクロ遠心チューブに2本の管から、ペレットを中断することなく、上清を慎重に移す。 ライセートの添加あたりの光ユニット（LU）を計算する。 LUを測定するために、新しいマイクロチューブにPBSを8μlのライセートの1μlを希釈する。直接希釈した混合物に1Xセレンテラジン基質100μlを加えるとすぐに5秒の読み取りとチューブルミノメーターを（20/20 Nターナーサイエンティフィック）を使用してチューブの発光を測定する。 -80アリコートで時間の長い期間の1〜2日またはストアするため-20℃でRUC -抗原のライセート℃にて保存してください。 PART 3：セラマスタープレートの準備最初に（50 mMトリス、pH 7.5、100mMのNaCl、5 mMのMgCl 2、1％トリトンX – 100）96ディープウェルポリプロピレンマイクロタイタープレートの各ウェルにバッファー450μlを添加することにより血清のマスタープレートを作る。このステップでは、染料、フェノールレッドは、また将来の血清サンプルの追加とLIPSのアッセイの他のステップを監視するためのトレーサーとして動作する（最終濃度は、バッファーに0.2μg/ mlの場合）バッファに含めることができます。 次の緩衝液A 450μlを含む別のウェルに各サンプルから血清50μlを追加するには、これは一般的に血清をマスタープレートの最後の二つのウェルに添加されていないバッファAの血清の1:10希釈ことに注意してくださいので、これは、バッファのブランクのために予約されています。 マスタープレートを使用する前に、それは広範囲にローテータプラットフォーム上で（1-2時間）振とうする。マスタープレートの血清はSTAです。少なくとも1ヶ月BLE（または長い）4℃、蒸発を防ぐために正しく保存されている場合。 後述のように、このマスタープレートを繰り返し、複数の抗原に対する血清中のプロファイリングのために削除される希釈血清10μlを提供します。大きくしたり小さくマスタープレートを使用することもできる。それが使用されていないパラフィルムでプレートをシール。 パート4：LIPSアッセイポリプロピレン96浅いウェルマイクロタイタープレートは、血清をテストするために使用されています。最初のステップでは、8チャンネルマイクロピペットを用いて96ウェルプレートの各ウェルにバッファー40μlを加える。 次のマスタープレートから希釈血清（1μlの血清と同等）の10μlを取り、8チャンネルマイクロピペットを用いてワーキングプレートの各ウェルに直接追加してください。 RUC -抗原の抽出物を含有するマスターミックスは、次の1 × 10 7ライトユニット（LU）を各ウェルに緩衝液50μlに追加されるように製剤化される。下の入力（わずか1 X 10 6）にも使用できますが、低ダイナミックレンジの結果をすることができます。各ウェルにこのマスターの混合物とRUC -抗原の混合物のピペットを50μlを加えます。 室温で1時間ロータリーシェーカー上でインキュベートする。 インキュベーション中に、新しい96ウェルフィルターHTSプレート（ミリポア、ベッドフォード、MA）の各ウェルの底にULTRALINKタンパク質PBSで/ Gビーズ（ピアースバイオテクノロジー、ロックフォード、IL）の30％懸濁液の5μlを追加。 1時間のインキュベーションの後、蛋白質8チャンネルマイクロピペットを使用して/ Gビーズを含む96ウェルフィルターHTSプレートに100μlのRUC -抗原抗体反応混合物を転送する。 室温でさらに1時間のためのロータリーシェーカー上で96ウェルフィルタープレートをインキュベートします。 次の真空マニホールドのフィルタープレートを洗浄する。各ウェルをPBS100μlで2回に続いて、バッファー100μlで8回洗浄する。これは、手動またはロボットピペッティングのワークステーションで実行できます。 最後の洗浄に続いて、真空がオフになっています。フィルタープレートを取り外して、紙タオルやプレートの上部と下部に水分を除去することを確認してろ紙のスタックを使用して乾燥さ汚点。 第5部：測定発光とデータ分析セットアップ： ベルトルトのLB 960セントロマイクロプレートルミノメーターは、各ウェル単一のインジェクタを使用して発光を測定するために使用されます。マシンの電源がオンになると、インジェクタの洗浄サイクルを使用して蒸留H 2 Oでインジェクタをすすいでください。セレンテラジンを基質は、製造業者によって記載されたようプロメガシイタケの基板キットを用いて調製される。 1Xセレンテラジン基板ミックスの一般的に6mlの（すなわち、60μlのセレンテラジンの株式に加え、1Xバッファー6 ml）をプライミングマシンのために準備し、つの完全な96ウェルプレートを実行しています。プレートを分析する前に、ベルトルトのLB 960セントロマイクロプレートルミノメーターは、1Xセレンテラジンの基板で準備されている。基質を注入し、プレートを読み取るための設定を含むプログラムファイルを開きます。これらの測定では、セレンテラジンを基質50μlを注入した、プレートは発光の読み取り5秒に続いて、2秒間振とうする。 プレートルミノメーターはプレート全体を読み取る能力がありますが、板の部分的な読み取りは、（読み込みメニューの下）を選択することができます。プレートの読み取りを開始するプログラムを起動します。 実行後、ルミノメーターでこぼれを防ぐために速やかにマイクロタイターフィルタープレートを取り外します。分析のためのExcel形式にMikroWinプログラムで生成されたデータをエクスポートします。 我々は、2つの独立した実行から血清を評価することをお勧めします。その後、データは各サンプルのLUの力価の値を生成するために平均化されます。これらの値は、さらにバッファのブランクを差し引き、調整することができます。 このようなカットを決定するなど、追加のデータ分析は、平均値と制御値の3または5の標準偏差を取ることによって計算することができます。

Discussion

LIPSは、最小限のアッセイの最適化と、そのシンプルさのために、高品質のデータは通常、任意の抗原に2週間の下でLIPSを使用して生成することができますが必要です。最も時間のかかる手順がクローニングされ、RUC -抗原の融合を含む適切なプラスミド発現ベクターを生成する。これらのプラスミドが生成されると、単一または複数の抗原は、急速に上記のような唇でテストすることができます。それは、LIPSはそのようなその血清はまた、チューブの形式であるいは分注ロボットワークステーションの助けを借りて、マイクロタイターフィルタープレート²または吸引ろ過付きプレートウォッシャーでテストすることができる非常に汎用性であることに留意すべきである。この高度にスケーラブルなシステムとは、人間の自己抗原³またはウイルスの⁴の全プロテオームのパネルのプロファイリングを並列LIPSが可能になります。それは、LIPSによって生成される多くの異なった抗体のプロファイルは、治療¹⁰のコースに続く、ワクチンの監視診断^3-9、抗原の発見⁹のに有用であると特定の疾患状態のため、一般的に公衆衛生のための広範な意味を持っている可能性が高いです。

Materials

Material Name	Typ	Company	Catalogue Number	Comment
HiSpeed Plasmid Midi KIt		Qiagen	12643
100 x 20 mm tissue culture dishes		Fischer	353003
Opti-MEM		Invitrogen	31985
FuGENE 6		Roche	1814443
Complete, Mini protease inhibitor cocktail		Roche	11836153001
Polypropylene 96 DeepWell 1 ml plate		Fischer	12-566-120	Deep well plate with lid and seal with Parafilm
Polypropylene microtiter plate		Fischer	12-566-120
HTS Filter plate		Millipore	MSBVN1B50
Ultralink Immobilized Protein A/G		Pierce	53133 (10ml)
Renilla Luciferase Assay System		Promega	E2820	For 2000 assays
Centro microplate luminometer		Berthold	LB 960