Tonen we het protocol voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met behulp van lentivirus-gemedieerde levering van de menselijke factoren Oct4, Sox2, NANOG, en Lin28. Pluripotentie werd bevestigd door morfologie en de aanwezigheid van embryonale stamcellen (ES) cel-specifieke merkers.
In 2006, Yamanaka en zijn collega's voor het eerst gedemonstreerd dat retrovirus-gemedieerde levering en expressie van Oct4, Sox2, c-Myc en Klf4 in staat is om de pluripotente staat in muis fibroblasten. 1 Dezelfde groep meldde ook de succesvolle herprogrammering van menselijke somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen met behulp van menselijke versies van dezelfde transcriptiefactoren geleverd door retrovirale vectoren. twee Bovendien, James Thomson et al.. gemeld dat de lentivirus-gemedieerde co-expressie van een andere set van factoren (Oct4, Sox2, NANOG en Lin28 ) was in staat om herprogrammering menselijke somatische cellen in iPS cellen. 3
iPS-cellen zijn vergelijkbaar met ES-cellen in morfologie, proliferatie en het vermogen om te differentiëren in alle soorten weefsels van het lichaam. Menselijke iPS cellen hebben een duidelijk voordeel ten opzichte van ES-cellen als ze vertonen de belangrijkste eigenschappen van embryonale stamcellen, zonder het ethische dilemma van de embryo's vernietigd. Het genereren van patiënt-specifieke iPS cellen omzeilt een belangrijk obstakel om gepersonaliseerde regeneratieve geneeskunde therapieën door het wegnemen van de kans op afstoting van niet-autologe getransplanteerde cellen.
Hier laten we zien het protocol voor herprogrammering menselijke fibroblast cellen met behulp van de Stemgent Human TF lentivirus Set. We tonen ook aan dat cellen die geprogrammeerd met deze set beginnen te iPS tonen morfologie vier dagen na de transductie. Met behulp van de Stemolecule Y27632, kozen we voor iPS cellen en waargenomen juiste morfologie na drie opeenvolgende rondes van kolonie plukken en passage. We tonen ook aan dat na de herprogrammering cellen weergegeven pluripotentie marker AP, oppervlakte markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, en SSEA-3, en nucleaire markers Oct4, Sox2 en NANOG.
Deze resultaten tonen aan dat de Stemgent Human TF lentivirus Set kan worden gebruikt om efficiënt iPS kolonies genereren door het induceren van de ectopische expressie van transcriptiefactoren getransduceerd in de menselijke fibroblasten. Bij het ontwerpen van herprogrammering experimenten moet met een aantal variabelen worden beschouwd als de efficiëntie van de herprogrammering te optimaliseren. Ten eerste kan de actieve virus-to-target ratio (multipliciteit van infectie MOI) moet worden gewijzigd tijdens de eerste stap naar een optimale transductie transductie efficiëntie te bereiken. Ten tweede kan de groei conditie van de doelcellen invloed herprogrammering. Gezonde en proliferatieve cellen zijn meer vatbaar voor herprogrammering. Ten derde, bij de wijziging van het protocol voor de verschillende cellen nummers, wordt aanbevolen dat de doelcel nummers proportioneel worden aangepast aan de oppervlakte van de cultuur schotel. Ten slotte moet het toepassen van ROCK-remmers, zoals Y27632 worden geacht om te helpen een succesvolle herprogrammering zorgen zoals recente studies hebben aangetoond dat het nut ervan bij het verbeteren van hES overlevingskans van de kolonie. 4,5
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Human TF Lentivirus Set | Stemgent | 00-0005 | ||
Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | ||
TRA-1-81 antibody | Stemgent | 09-0012 | ||
TRA-1-60 antibody | Stemgent | 09-0009 | ||
SSEA-4 antibody | Stemgent | 09-0003 | ||
SSEA-3 antibody | Stemgent | 09-0014 |