Campo eléctrico externo provoca una tensión en la membrana de una célula, denominada tensión de la membrana inducida (ΔΦ). Mediante el uso de la tintura potenciométrica di-8-ANEPPS, es posible medir el ΔΦ no invasiva. Este video muestra el protocolo para la medición de ΔΦ con di-8-ANEPPS.
La colocación de una celda en un campo eléctrico externo provoca una redistribución de carga en el interior local y exterior de la célula en los alrededores de la membrana celular, lo que resulta en un voltaje a través de la membrana. Este voltaje, llamado el voltaje de la membrana inducida (tensión inducida también transmembrana, o la diferencia de potencial transmembrana inducida) y se denota por ΔΦ, existe sólo mientras el campo externo está presente. Si la tensión de reposo está presente en la membrana, la tensión inducida superpone (agrega) en la misma. Mediante el uso de uno de los tintes fluorescentes potenciométrica, como di-8-ANEPPS, es posible observar las variaciones de ΔΦ en la membrana celular y para medir su valor forma no invasiva. di-8-ANEPPS se convierte en fuertemente fluorescente cuando se une a la bicapa lipídica de la membrana celular, con el cambio de la intensidad de fluorescencia proporcional al cambio de ΔΦ. Este video muestra el protocolo para la medición de ΔΦ con di-8-ANEPPS y también demuestra la influencia de la forma celular de la amplitud y la distribución espacial de ΔΦ.
Las mediciones de la membrana inducido (transmembrana) de tensión, ΔΦ, puede ser importante en diversos parámetros experimentales, tales como estudios de los canales de membrana voltaje-dependientes, propagación de potenciales de acción, la estimulación de células cardíacas, o la electroporación de la membrana celular [3, 4, 5, 6 , 7]. Con formas simples de células, ΔΦ se puede calcular analíticamente. Por ejemplo, para una célula esférica, ΔΦ está dada por la ecuación de Schwan s, que establece que la tensión es proporcional a la intensidad de campo y el tamaño celular y sigue a la función del coseno a lo largo de la membrana [8, 9]. Para más formas de células complicado, ΔΦ pueden desviarse considerablemente de la del coseno y debe ser determinado numéricamente, usando una computadora [2, 10, 11], o de forma experimental, utilizando un medio de potenciométrica [12, 13, 14, 15].
Uno de los colorantes potenciométricos utilizados para este propósito es di-8-ANEPPS (di-8-butil-amino-naftil-etilen-piridinio-propil-sulfonato), un tinte rápido con los espectros de excitación y de emisión depende de la tensión de la membrana, que permite que las observaciones no invasivo de las variaciones de la ΔΦ en la membrana celular y para medir su valor. En este vídeo, se muestra un enfoque experimental para la determinación de ΔΦ mediante el uso de di-8-ANEPPS.
El colorante fue desarrollado por el profesor Leslie Loew y sus colegas [13, 14] en la Universidad de Connecticut, y pertenece a la clase de respuesta rápida colorantes. di-8-ANEPPS es no fluorescente en el agua y se convierte en fuertemente fluorescente cuando se incorpora en la bicapa lipídica de la membrana celular. Un cambio en los resultados de ΔΦ en un cambio de la distribución de carga intramolecular y los correspondientes cambios en el perfil espectral y la intensidad de la fluorescencia del colorante. La intensidad de fluorescencia de di-8-ANEPPS varía proporcionalmente al cambio de ΔΦ, la respuesta de la tintura es lineal para las tensiones que van desde -280 mV a 250 mV [4, 16]. Cambios relativamente pequeños en la fluorescencia de las manchas del tinte, la membrana irregular, y la internalización de tinte que di-8-ANEPPS menos adecuados para la medición absoluta de la tensión de la membrana, por ejemplo, su componente de descanso, a pesar de estos esfuerzos también se informó [17]. Es, sin embargo, adecuada para medir los cambios más grandes en el voltaje de la membrana, tales como la aparición de la tensión de la membrana en las células no excitables inducida expuestos a campos eléctricos externos [12, 13], o potenciales de acción en las células excitables [4, 5]. Aunque no se aplica aquí, di-8-ANEPPS también permite la determinación de las mediciones ΔΦ radiométrica de excitación de fluorescencia [18] o de las emisiones [19], lo que aumenta la sensibilidad de la respuesta y reduce los efectos antes mencionados. Como di-8-ANEPPS manchas de la membrana, sino que también puede ser utilizado simplemente como un marcador de membrana [2].
Uno de los inconvenientes de la tintura es que es propenso a photobleaching, por lo que la exposición prolongada a la luz fuerte se debe evitar. La calibración de la tintura se realiza ya sea con valinomicina ionóforo (i) de potasio y un conjunto de diferentes concentraciones de potasio en el medio externo [2,18], o (ii) de patch-clamp en el modo de fijación de voltaje [17].
Finalmente, con las medidas de ΔΦ en células esféricas y las células de formas más complejas, el video muestra la influencia de la forma de la célula en la distribución espacial de la amplitud y ΔΦ. Así, por células esféricas ΔΦ está cerca de un coseno, de acuerdo con la ecuación de Schwan, mientras que para las formas más complicadas de células de la distribución espacial de ΔΦ es más complejo [20] …
Este trabajo fue apoyado por la Agencia de Investigación de Eslovenia con el proyecto de Z2-9229 y el programa P2-0249. Este video representa el material complementario para la "base de electroporación, tecnologías y tratamientos" taller científico y postgrado, organizado cada dos años por la Facultad de Ingeniería Eléctrica de la Universidad de Ljubljana, en Eslovenia.
Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
di-8-ANEPPS | Invitrogen | D-3167 | potentiometric fluorescent dye | |
pluronic | Invitrogen | P3000MP | potassium ionophore | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | ||
SMEM | Sigma-Aldrich | M8167 or M4767 | Spinner modification of the Minimum Essential Medium | |
Ham-F12 | Sigma-Aldrich | N4888 | culture medium | |
fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F4135 | ||
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | ||
crystacillin | Pliva | 625110 | antibiotic | |
gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic | |
Lab-Tek II | Nalge Nunc | 155379 | chamber | |
DC voltage supply | Elektro-Automatik | |||
microprocessor-controlled switcher | Custom made | |||
electrodes | Custom made | Pt/Ir |