Campo elettrico esterno induce una tensione sulla membrana di una cellula, chiamata potenziale di membrana indotta (ΔΦ). Usando il potenziometrica tintura di-8-ANEPPS, è possibile misurare la ΔΦ modo non invasivo. Questo video mostra il protocollo per la misurazione ΔΦ utilizzo di-8-ANEPPS.
Posizionamento di una cella in un campo elettrico esterno provoca un locale all'interno di ridistribuzione della carica e al di fuori della cellula in prossimità della membrana cellulare, con una conseguente tensione attraverso la membrana. Questa tensione, chiamata tensione indotta membrana (tensione transmembrana anche indotta, o indotto differenza di potenziale transmembrana) e indicato con ΔΦ, esiste solo fino a quando il campo esterno. Se la tensione a riposo è presente sulla membrana, la tensione indotta sovrappone (aggiunge) su di esso. Usando uno dei coloranti fluorescenti potenziometrico, come di-8-ANEPPS, è possibile osservare le variazioni della ΔΦ sulla membrana cellulare e di misurare il suo valore non invasivo. di-8-ANEPPS diventa fluorescente quando fortemente legato al doppio strato lipidico della membrana cellulare, con il cambiamento delle intensità di fluorescenza proporzionale alla variazione di ΔΦ. Questo video mostra il protocollo per la misurazione ΔΦ utilizzo di-8-ANEPPS e dimostra anche l'influenza della forma cella l'ampiezza e la distribuzione spaziale della ΔΦ.
Misure della membrana indotta (transmembrana) tensione, ΔΦ, può essere importante in varie impostazioni sperimentali, come studi di canali voltaggio-dipendenti della membrana, la propagazione del potenziale d'azione, la stimolazione delle cellule cardiache, o membrana elettroporazione di cellule [3, 4, 5, 6 , 7]. Con forme semplici cellule, ΔΦ può essere calcolato analiticamente. Ad esempio, per una cellula sferica, ΔΦ è data dalla equazione della Schwan s, in cui si afferma che la tensione è proporzionale alla forza del campo e le dimensioni delle cellule e segue la funzione coseno lungo la membrana [8, 9]. Per ulteriori forme cellulari complicati, ΔΦ possono discostarsi notevolmente dal coseno e deve essere determinato o in forma numerica, utilizzando un computer [2, 10, 11], o sperimentale, utilizzando un colorante potenziometrica [12, 13, 14, 15].
Uno dei coloranti potenziometrico ampiamente utilizzato per questo scopo è di-8-ANEPPS (di-8-butil-amino-naftil-etilene-piridinio-propil-solfonato), un colorante veloce con eccitazione e spettri di emissione dipende dal potenziale di membrana, non invasivo che permette osservazioni delle variazioni delle ΔΦ sulla membrana cellulare e di misurare il suo valore. In questo video, ci mostrano un approccio sperimentale per la determinazione di ΔΦ utilizzando di-8-ANEPPS.
Il colorante è stato sviluppato dal professor Leslie Loew e colleghi [13, 14] presso l'Università del Connecticut e appartiene alla classe di risposta rapida coloranti. di-8-ANEPPS è nonfluorescent in acqua e diventa fortemente fluorescenti quando si incorpora nel doppio strato lipidico della membrana cellulare. Un cambiamento nei risultati ΔΦ in un cambiamento della distribuzione di carica intramolecolare e corrispondenti cambiamenti nel profilo spettrale e l'intensità di fluorescenza del colorante è. L'intensità della fluorescenza di di-8-ANEPPS varia proporzionalmente alla variazione del ΔΦ, la risposta del colorante è lineare per tensioni che vanno da -280 mV a +250 mV [4, 16]. Cambiamenti relativamente piccoli nella fluorescenza del colorante, colorazione irregolare della membrana, e interiorizzazione colorante fare di-8-ANEPPS meno adatti per la misura assoluta del potenziale di membrana, ad esempio, la sua componente di riposo, anche se tali sforzi sono stati segnalati anche [17]. E ', tuttavia, adatto per misurare grandi variazioni di tensione della membrana, come l'insorgenza di potenziale di membrana indotta in cellule nonexcitable esposti a campi elettrici esterni [12, 13], o potenziali d'azione nelle cellule eccitabili [4, 5]. Anche se non è qui applicata, di-8-ANEPPS permette anche la determinazione del ΔΦ da misurazioni raziometrico di eccitazione di fluorescenza [18] o di emissione [19], che aumenta la sensibilità della risposta e riduce gli effetti di cui sopra. Come di-8-ANEPPS macchie la membrana, che può essere utilizzato anche chiaramente come marker di membrana [2].
Uno degli svantaggi del colorante è che è incline a photobleaching, in modo che l'esposizione prolungata alla luce forte dovrebbe essere evitato. Calibrazione del colorante viene eseguita con o (i) valinomicina ionoforo di potassio e un insieme di diverse concentrazioni di potassio in mezzo esterno [2,18], o (ii) patch-clamp in modalità morsetto di tensione [17].
Infine, con le misure di ΔΦ sulle cellule sferiche e le cellule di forme più complesse, il video dimostra l'influenza della forma delle cellule sulla distribuzione spaziale di ampiezza e ΔΦ. Così per le cellule sferiche ΔΦ è vicino ad una coseno, in accordo con l'equazione Schwan, mentre per ulteriori forme di cellule complicata la distribuzione spaziale della ΔΦ è più complessa [20] …
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Agenzia di ricerca sloveno con il progetto Z2-9229 e programma P2-0249. Questo video rappresenta il materiale integrativo per la "Elettroporazione basato Tecnologie e Trattamenti" laboratorio scientifico e corso post-laurea, organizzato ogni due anni dalla Facoltà di Ingegneria Elettrica presso l'Università di Lubiana, Slovenia.
Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
di-8-ANEPPS | Invitrogen | D-3167 | potentiometric fluorescent dye | |
pluronic | Invitrogen | P3000MP | potassium ionophore | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | ||
SMEM | Sigma-Aldrich | M8167 or M4767 | Spinner modification of the Minimum Essential Medium | |
Ham-F12 | Sigma-Aldrich | N4888 | culture medium | |
fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F4135 | ||
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | ||
crystacillin | Pliva | 625110 | antibiotic | |
gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic | |
Lab-Tek II | Nalge Nunc | 155379 | chamber | |
DC voltage supply | Elektro-Automatik | |||
microprocessor-controlled switcher | Custom made | |||
electrodes | Custom made | Pt/Ir |