이 프로토콜은 KLRG1 리간드의 분석을위한 강력한 도구입니다 KLRG1 tetramer의 생산을 설명합니다.
Abstract
킬러 세포 렉틴 같은 수용체 G1 (KLRG1)은 C 타입 렉틴 같은 superfamily에 속하는 유형 II의 transmembrane의 당단백질 수용체 억제합니다. KLRG1는 단량체로서 이황화 결합 homodimer로 모두 존재합니다. 이 잘 보존되어 수용체가 가장 성숙하고 최근에 활성화된 NK 세포에서뿐만 아니라 효과기 / 메모리 T 세포의 일부에서 발견됩니다.
KLRG1 tetramer뿐만 아니라 다른 방법을 사용하여, E -, N – 및 R – cadherins은 KLRG1 리간드로 확인되었습니다. 이러한 칼슘 2 +에 의존 세포 – 세포 부착 분자는 세포 – 세포 상호 작용, transmembrane 도메인과 굴지의 cytoskeleton에 연결된 세포질 도메인에 대해 책임을 다섯 cadherin의 반복을 포함하는 세포외 도메인에 구성되어 있습니다.
KLRG1 tetramer의 생성은 KLRG1 리간드의 식별에 필수되었습니다. KLRG1 tetramer 또한 면역 반응 및 조직 무결성을 규제의 역할 cadherin과 KLRG1 재생을 명료하게하다 수있는 유일한 도구입니다.
Protocol
포함 기관의 준비 TB 4 X 500 ML flasks의 예방 각각 KLRG1 플라스미드 구조를 표현하는 박테리아의 야간 문화와 50 μg / carbenicillin과 chloramphenicol의 ML을 포함. OD 600 nm의에서 0.6 A를 도달하면, 37에서 0.4 M IPTG의 추가와 함께 유도하고 떨고 추가 4 시간 동안 문화를 품어 ° C. resuspension 버퍼 산도에서 수확한 세포를 Resuspend = 8.0 (50 MM 트리스 – HCL, 25 % (W / V) 자당, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트?…
Discussion
이 프로토콜에서는, 그것은 biotinylate, 정화하는 방법을 표시하고, tetramerize KLRG1입니다. KLRG1 tetramer는 유동세포계측법로 KLRG1 리간드 레이블을 사용할 수 있습니다. refolding 조건이 각각의 단백질에 대해 경험적으로 테스트해야되지만, 다른 C – 타입 lectins은 유사한 프로토콜을 사용 tetramerized 수 있습니다. 프로브, 고아 C – 타입 렉틴 수용체에 리간드로 tetramerized 단백질을 사용하면 잠재적으로 식별 ?…
Acknowledgements
우리는 refolding 조건을 최적화에 대한 도움 박사 Naidenko 감사합니다. 이 작품은 로랑 Brossay에 NIH 연구 부여 AI58181에 의해 지원되었다. 신디 반은 NIH NRSA F31 AI080230에 의해 지원됩니다.
스테파니 Terrizzi와 신디 반이 작품에 동등하게 기여하고 있습니다.
Materials
Material Name
Typ
Company
Catalogue Number
Comment
BirA Enzyme and Buffer
Biotinylation Kit
Avidity
BIRA500
Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free