此处所描述的卡弗里膜的结构与功能的生物集团成立手动油脂介孔膜蛋白的结晶试验实施的过程。
使用油脂介孔膜蛋白结晶的一个详细的协议描述。这种方法有不同的被称为油脂立方相, 或在中观方法。该方法已被证明是相当通用的,因为它已被用于解决X射线晶体结构的原核和真核细胞的蛋白质,蛋白质是单体,同源异多聚体,生色含和生色,和alpha螺旋和β-管蛋白。最近取得的成功观的结晶,是人类设计的β2-肾上腺素和腺苷A2A G蛋白偶联受体。协议提出的重组膜蛋白的monoolein为基础的中间相,并设立在手动模式下的结晶。额外的步骤,在整个过程中,如水晶收获,要在未来的视频文章处理。所需的时间准备蛋白质装载的中间相,并设立结晶板,手工大约一个小时。
立方相是一个微妙的和动态的环境可以改变一个变量的数目急剧变化。这是不可能的,给予说明在手动模式下,描述了所有潜在的隐患的中间结晶试验的设置。然而,许多困难,可避免通过练习前把它应用到昂贵的蛋白质溶液的技术和应用在混合注射器的压力放缓。做得正确, 在中观方法可以产生各种各样的蛋白质晶体,其数量是不断增加。
这里设置在中间的结晶试验的描述主要集中在手动模式。这个过程就可以了,经常被修改,以促进在这些情况下,需要大规模的结晶条件筛选的结晶板自动设置。
有很多人对这项工作作出了贡献和最卡弗里膜结构与功能的生物集团,过去和现在的成员。我们致以最热烈的感谢和赞赏。这项工作是支持的,一部分由爱尔兰科学基金会(07/IN.1/B1836),(GM75915)国家卫生研究院和利默里克大学的补助金。
Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Protein solution | Reagent | Various | Various | |
Lipid (monoolein) | Reagent | Sigma/NuCheck | Various | |
Precipitant solutions | Reagent | Various | Various | |
Purified water | Reagent | Millipore | ||
Pipetting devices | Tool | Pipetman | Various | |
Disposable pipet tips | Disposable | Pipetman | Various | |
Gas-tight syringes | Tool | Hamilton | 80265 (25-μl) | |
Syringe tips | Tool | Hamilton | 7770-020 (gauge 22) | |
Narrow bore coupler* | Tool | Hamilton/Emerald | various/EBS-LCP-2 | |
Repeating dispenser | Tool | Hamilton | 83700 | |
Silanized glass microscope slides | Disposable | GoldSeal | 3010 | |
microscope coverslips | Disposable | Fisher Scientific | 12-548C | |
Perforated double-stick spacer tape | Disposable | Saunders Corporation (hole-punched) | NA | |
Tweezers | Tool | Various | NA | |
Brayer (roller) | Tool | Fisher Scientific | 50820937 | |
Chipped ice | Temperature Control | NA | NA | |
Tissues | Disposable | NA | NA | |
Calculator | Tool | Various | NA | |
Lab notebook | Tool | Various | NA |
* Full details for machining your own Narrow Bore Coupler are provided in Reference 3.