Görüntüleme Uyuşmazlığı DNA Hasar Onarım ve Hücresel Yanıtları Bacillus subtilis</em
Summary
Ayrıntılı bir protokol görüntüleme için DNA onarım komplekslerin gerçek zamanlı oluşumu açıklanmıştır<em> Bacillus subtilis</em> Hücreler.
Abstract
Hem prokaryot ve ökaryotlarda DNA hasarı karmaşık bir dizi fizyolojik değişiklikler ile yanıt verir. Gen ekspresyonu, mevcut proteinlerin yeniden dağıtımı ve yeni protein kompleksleri montaj değişiklikler DNA lezyonları ve eşleşmeyen DNA baz çifti çeşitli teşvik edilebilir. Floresan mikroskopi DNA lezyonları ve karmaşık hücre içi mimari canlı bir hücre içinde DNA replikasyon durumunu izlemek için bu ve diğer tepkiler görselleştirilmesi ve ölçülmesi için güçlü bir deney aracı olarak kullanılmıştır. , Floresan muhabiri proteinleri ve DNA replikasyonu ve tamiri makine bileşenleri arasında Translasyonel füzyonlar ipuçlarını belirlemek için kullanılan hedef DNA onarım proteinleri cognate lezyonlar<em> In vivo</em> Ve bu proteinlerin bakteri hücrelerinin içinde nasıl organize edilir, anlamak için. Buna ek olarak, DNA hasarı indüklenebilir sahiplerine bağlanan transkripsiyonel ve translasyonel füzyonlar nüfus içinde hücre genotoksik stres yanıtları aktif olduğunuz ortaya koymuştur. Bu derlemede, floresan mikroskobu kullanarak görüntü, DNA onarım ve tek bir bakteri hücrelerinin DNA replikasyonu kompleksleri montaj için detaylı bir protokol sağlar. Özellikle, bu çalışmanın görüntüleme uyumsuzluğu onarım proteinler, homolog rekombinasyon, DNA replikasyonu ve SOS-indüklenebilir bir protein üzerinde duruluyor<em> Bacillus subtilis</em>. Burada açıklanan tüm prosedürler bakteri türlerinin çeşitli görüntüleme protein kompleksleri kolayca mükellef bulunmaktadır.
Protocol
Discussion
Deneme ve yanılma her suşu için yüksek kaliteli görüntüler için maruz kalma koşullarını bulmak için gereklidir; 100 2000 ms pozlama GFP (FITC) ve FM4-64 için uygun iken, 1 milisaniye beyaz ışık görüntüler için uygun olduğunu bulmak (TRITC ) görüntüleri. Pozlama süresi kullanılan görüntüleme cihazları bağlı olarak değişecektir. Biz, aynı slaytta birden fazla suşları mevcuttur ped ped sınır hücrelerinin kalite ve difüzyon gerginlik farklılaşma karmaşık hale getirebilir basit g?…
Acknowledgements
Yazarlar Dr teşekkür etmek istiyorum. Başlangıçta floresan mikroskopi LAS eğitim için Philina S. Lee ve Alan D. Grossman. Yazarlar ayrıca teşekkür Dr. Yardım ve ipuçları görüntüleme için Melanie Berkmen ve Hajime Kobayashi. Bu çalışma, Edebiyat, Fen-Edebiyat Fakültesi ve Michigan Üniversitesi, Moleküler, Hücresel ve Gelişimsel Biyoloji Bölümü start-up fonları tarafından desteklenen oldu.
Materials
Specific solution recipes1:
10x S750 salts
0.5 M MOPS
100 mM Ammonium Sulfate
50 mM Potassium Phosphate Monobasic
Filter sterilize, and wrap S750 media in foil prior to storage
100x Metals
0.2 M MgCl2
70 mM CaCl2
5 mM MnCl2
0.1 mM ZnCl2
100 μg/mL Thiamine HCl
2 mM HCl
0.5 mM FeCl3*
dH2O to final volume
*FeCl3 should be added last, to prevent precipitation.
After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil.
S750 media
1x S750 salts
1x Metal
1% Glucose
0.1% Glutamate
40 μg/mL Tryptophan
40 μg/mL Phenylalanine
distilled H2O to final volume
10x Spizizens (grams/L)
151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L)
803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L)
440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L)
34.0 mM Sodium Citrate (10g/L)
16.6 mM MgSO4 (2g/L)
dH2O to final volume
Filter sterilize
Referenzen
- Hardwood, C. R., Cutting, S. M. . Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).
- Berkmen, M. B., Grossman, A. D. Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle. Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).
- Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis. Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).
- Simmons, L. A. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. Visualization of mismatch repair in bacterial cells. Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).
