Purification de la M. magneticum Strain AMB-1 Protein magnétosome Associated MamAΔ41
Summary
Mama est un unique protéines associées magnétosome qui a été montré pour être impliqués dans l'activation magnétosome. Nous présentons ici le protocole de purification de Mama mutant de délétion (MamAΔ41) de<em> M. magneticum</em> AMB-1.
Abstract
Bactéries magnétotactique constituent un groupe diversifié de micro-organismes aquatiques qui sont capables de s'orienter le long des champs géomagnétiques. Ce comportement est considéré comme une aide leur recherche d'environnements adaptés<em> (1)</em>. Cette capacité est conférée par l'magnétosome, un organite intracellulaire qui se compose d'un assemblage linéaire de la chaîne des vésicules lipidiques de chaque mesure de biomineralize et joignez un ~ 50-nm cristaux de magnétite ou greigite. Une composante principe de la magnétosome qui a été montré pour être requis pour la formation de vésicules fonctionnelle est maman. Maman est une très abondante magnétosome protéine associée qui est l'un des plus caractérisé magnétosome protéines associées<em> In vivo</em><em> (2-6)</em>. Cet article se concentre sur la purification de la maman, qui en dépit d'être étudiée<em> In vivo</em>, Aucun des détails clairs fonctionnelles ou structurales ont été identifiées pour elle. L'analyse bioinformatique a suggéré que Mama est une répétition de tétra-tricopeptide (TPR), contenant des protéines. TPR est un motif structural trouve que cette partie ou d'une plus grande formation de pli dans une large gamme de protéines, il sert de modèle pour les interactions protéine-protéine et sert de médiateur complexes multi-protéiques<em> (7)</em>. TPR sont impliqués dans de nombreuses tâches essentielles dans le processus eucaryotes organite cellulaire et de nombreuses voies de bactéries<em> (8-14).</em> Afin de comprendre Mama, un TPR uniques contenant des protéines, la protéine hautement purifiée est nécessaire dans un premier temps. Dans cet article, nous présentons le protocole de purification d'un mutant stable Mama suppression (MamAΔ41) de<em> M. magneticum</em> AMB-1.
Protocol
Discussion
Purification des protéines est l'étape principale dans toutes les protéines biochimiques ou des études structurales. Comme chaque protéine est unique avec son propre comportement, on a besoin de définir ses propriétés et de modifier en conséquence sa purification. Protéine cible doit être analysé comme une première étape vers la purification à l'aide d'outils bioinformatiques. Ils sont utilisés pour calculer la cible point isoélectrique, d'évaluer son besoin de réduction / oxydation en…
Acknowledgements
Nous reconnaissons le Dr Amir Aharoni pour son soutien et Geula Davydov, Noam Grimberg et Chen Guttman, pour leurs conseils et commentaires.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| French Press | Equipment | Thermo scientific | FA-078A | |
| Pressure cell | Equipment | Thermo scientific | FA-032 | |
| Ultra-centrifuge | Equipment | Sorvall | Discovery 90SE | |
| Rottor | Equipment | Beckman | Ti60 | |
| Ultra-centrifuge tubes; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml | Equipment | Beckman | BC-355618 | |
| 2.5cm diameter, Glass Econo-Column Chromatography Columns | Equipment | BioRad | 737-2521 | |
| Ni-NTA His Bind resin | Equipment | Novagen | M0063428 | |
| Spectrophotometer | Equipment | Amersham Biosiences | Ultraspec 2100 pro | |
| Quartz cuvette | Equipment | Hellma | 104-QS | |
| Fast Performance Liquid Chromatography- AKTA purifier 10 | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 28-4062-64 | |
| Ion exchange column – MonoQ 4.6/100 PE | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 10025543 | |
| Size exclusion pre-packed column-HiLoad 26/60 Superdex 200 | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 17-1071-01 | |
| Centricon – Vivaspin15 – 10,000 MWCO | Equipment | Sartorius Stedim Biotech GmbH | VS1501 | |
| Table centrifuge | Equipment | Thermo scientific | IEC CL30R | |
| MALDI-TOF | Equipment | Bruker Daltonics | Reflex IV | |
| Tris-HCl (hydrotymethyl) aminomethane | Reagent | BioLab | 20092391 | |
| Sodium Chloride | Reagent | FRUTROM | 235553470 | |
| Imidazole | Reagent | Alfa Aesar | 288-32-4 | |
| EDTA free protease inhibitors cocktail | Reagent | Sigma | P-8849 | |
| Dnase I (Deoxyribonuclease I) | Reagent | Sigma | DN-25 | |
| Bovine Thrombin | Reagent | Fisher BioReagents | BP25432 | |
| Glycine | Reagent | BioLab | 07132391 | |
| Soudim Dodecyl Sulfate (SDS) | Reagent | BioLab | 19822391 | |
| Beta-mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M-3148 | |
| InstantBlue | Reagent | Expedeon | 1SB01L | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Reagent | Fermentas | SM0671 |
Referenzen
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