Bu video in vitro anjiyogenez tayininde bir protokol anjiyogenez özetlediği çeşitli aşamaları olduğunu göstermektedir. Zaman atlamalı çimlenme görüntüleri, lümen oluşumu, dallanma ve anastomoz – anjiyogenez temel özellikleri gösterilmektedir.
Abstract
Anjiyogenez anjiyogenik uyaranlara yanıt olarak, yeni damarlar mevcut damarsal oluşturulan karmaşık çoklu adımlı bir süreçtir. Bu adımlar şunlardır: ekstrasellüler matriks, kablosuna AT uyum içine endotel hücreleri bazal membran, proliferasyon ve göç (çimlenme) (EC) bozulması, dallanma, lümen oluşumu, anastomoz, ve yeni bir bazal membran oluşumu. In vitro tayinlerde, bu süreç pek çok çalışma için geliştirilmiş, ancak çoğu sadece belirli aşamalarında anjiyogenez taklit ve morfolojik testlerin içinde gemilerin çoğu in vivo gemileri benzemez edilmiştir. Nehls ve Drenckhahn tarafından daha önceki çalışmaları üzerine dayanarak, insan umbilikal ven EC ve fibroblastlar kullanır in vitro anjiyogenez tayininde bir iyimserlik var. Bu model özetlediği anjiyogenez en önemli erken aşamalarında ve daha da önemlisi, gemilerin polarize Avrupa Komisyonu tarafından çevrili patent hücrelerarası lümen gösterilecek. EC cytodex microcarriers üzerine kaplanmış ve fibrin jel içine gömülü. Fibroblastlar EC boncuk yüzeyinden çimlenme teşvik gerekli çözünür faktörlerin sağlayan jel üstünde katmanlı. Birkaç gün sonra, çok sayıda gemiler, faz-kontrast ve zaman atlamalı mikroskobu altında kolayca gözlenebilir olduğunu mevcut. Bu video bu kültürlerin kurulmasında önemli adımlar gösteriyor.
Protocol
HAZIRLAMA HÜCRELERİ FBS / Pen-Strep (1:100) 1-2 gün boncuk önce M199/10% HUVEC ve fibroblastlar getirin. Fibroblastlar için gömmeden önce HUVEC ve gün için boncuk önce EGM-2 (Clonetics) gün orta açın. ~ 400 HUVEC başına boncuk bir konsantrasyon gereklidir. Ortalama 20.000 fibroblastlar ihtiyaç vardır. HUVEC İLE BONCUK KAPLAMA – GÜN -1 HUVEC Trypsinize. Boncuk (SANTRİFÜJ VERMEYİN!) Yerleşmek için izin ve…
Discussion
, In vitro anjiyogenez deneylerde üç boyutlu (3D) 2D kültürleri kullanılarak elde edilebilir in vivo daha gerçek bir ortamda daha yakın bir model sunuyoruz artan bir fikir birliği yoktur. Bu üstün 3D sistemleri tekrarlanabilir ve anjiyogenez önemli adımlar birkaç taklit etmek mümkün gerektiği açıktır. Önceki birkaç 3D testleri geliştirilmiş olsa da, bunların pek çoğu ya mikrovasküler hücreleri elde etmek için zor kullanmak, ya da sadece bazı aşamaları özetlemek. Bu video, açıklamak ve vasküler araştırma…
Materials
Material Name
Typ
Company
Catalogue Number
Comment
Cytodex-3 Beads
Reagent
Amersham Pharmacia
17-0485-01
10 g/bottle.
1. 0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH=7.4) for at least 3 hours at RT.
Use a 50 mL tube and place it on the rocker.
2. Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL).
3. Discard the PBS and replace with fresh PBS:
25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or
50 mL -> 10 mg/mL => 30000 beads/ mL
4. Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote).
5. Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115C.
6. Store it at 4C.
Aprotinin
Reagent
Sigma
A-1153
10mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20C.
Fibrinogen Type I
Reagent
Sigma
F-8630
1g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBS
Note clottable protein % and adjust accordingly
Heat in a 37C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex.
Sterile filter through 0.22 um
Thrombin
Reagent
Sigma
T-3399
22 mg=1000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20C.
Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186, doi:10.3791/186 (2007).