La fertilisation des Ovocytes de Xenopus En utilisant la méthode de transfert d'hôte
Summary
Procédure pour la fertilisation<em> Ovocytes de Xenopus</em> Par la méthode de transmission de l'hôte.
Abstract
Etudier l'apport de molécules hérité de la mère au développement précoce des vertébrés est souvent entravée par le temps et les dépenses nécessaires pour produire des animaux mutants à effet maternel. De plus, de nombreuses techniques pour surexprimer ou inhiber la fonction des gènes dans des organismes comme le poisson-zèbre et le xénope ne parviennent pas à suffisamment cible critique maternelle voies de signalisation, tels que la signalisation Wnt. Chez le xénope, la manipulation de la fonction des gènes dans les ovocytes en culture et par la suite les fertiliser peut améliorer ces problèmes dans une certaine mesure. Les ovocytes sont manuellement defolliculated à partir de tissus d'ovaire donateurs, injecté ou traité dans la culture comme souhaité, et ensuite stimulées avec de la progestérone pour induire la maturation. Ensuite, les ovocytes sont introduits dans la cavité du corps d'une grenouille hôte ovulation féminine, après quoi ils seront transporté dans l'oviducte de l'hôte et l'acquisition des modifications et des manteaux de gelée nécessaires à la fécondation. Les embryons ainsi obtenus peuvent ensuite être porté à la scène désirée et analysées pour les effets de toute perturbations expérimentales. Cette méthode de transfert de l'hôte a été très efficace dans la découverte des mécanismes de base du développement précoce et permet un large éventail de possibilités expérimentales ne sont pas disponibles dans tous les autres vertébrés organisme modèle.
Protocol
Discussion
Un transfert réussi aboutira à la fécondation et de clivage normal de> 50% des ovocytes (Figure 3). Généralement entre 30-60% des ovocytes transfert va survivre dernières étapes neurula. Nous transfèrent habituellement de 75 à 150 ovocytes par groupe expérimental, ce qui donnera suffisamment d'embryons pour plusieurs types d'analyses (in situ, RT-PCR) ainsi que la visualisation du phénotype. L'implantation d'ovocytes nettement plus ne semble pas augmenter considérablement le rendement. En …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire de Houston pour la lecture critique du manuscrit. La recherche est soutenue par le National Institutes of Health (GM083999) attribué à DWH
Materials
Solutions and recipes:
OCM (Oocyte culture medium; modified from Wylie et al., 1996)
| 70% Leibovitz’s L-15 medium (containing l-glutamine) | (Invitrogen 11415-064) |
| 0.4 mg/ml Bovine serum albumin (BSA; fraction V) | (Sigma A-9418-50g) |
| 1x Penicillin-Streptomycin | (Sigma P-0781) |
| Adjust to pH 7.6-7.8 with 5N NaOH | |
| Make fresh weekly, store at 18°C. | |
10X MMR (Marc’s Modified Ringer’s Solution; Zuck et al., 1998)
| 1M NaCl |
| 20 mM KCl |
| 20 mM CaCl2 |
| 10 mM MgCl2 |
| 150 mM HEPES |
| adjust to pH 7.6-7.8 |
| Store at 4°C |
Anesthetic solution
| 1 g/L 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (MS222) | (Sigma A-5040) |
| 0.7 g/L sodium bicarbonate | |
| Dissolve in Amquel-treated water | |
| Make fresh weekly | |
Progesterone stocks
| 10 mM Progesterone (Sigma P- 0130) in 100% Ethanol |
| Dilute to 1 mM in 100% EtOH for a 500x stock/working solution |
| Store at -20°C |
Vital dyes (modified from Heasman et al., 1991)
| Blue: 0.1% Nile Blue A | (Aldrich 121479-5G), |
| Red: 0.25% Neutral Red | (Sigma N-6634), |
| Brown: 1% Bismarck Brown | (Sigma B-2759), |
| Green (80 μl blue + 80 μl brown), | |
| Mauve (80 μl blue + 80 μl red). | |
| A sixth color, Orange (80 μl red+ 80 μl brown), can also be used but is often hard to distinguish from brown. | |
Stocks of Blue, Red and Brown are made up in deionized water in 50 ml tubes, incubated for 20 minutes with rocking and spun in a clinical centrifuge. The supernatants are aliquotted into microfuge tubes and stored at -20°C.
Referenzen
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