Ontleding van Organisator en dierlijke Pole Explantaten van Xenopus laevis embryo's en montage van een Celadhesie Assay

Summary

Deze video toont de techniek die gebruikt wordt voor de voorbereiding van organisator en dier pole explantaten van Xenopus laevis embryo's, waaronder het gebruik van de wenkbrauw mes – een speciale tool gemaakt dissectie van je wenkbrauw. Het protocol voor het monteren van een adhesie-test wordt ook gegeven, die probes voor de aanwezigheid van belangrijke adhesiemoleculen op het oppervlak aanwezig organisator of dierlijke paal cellen die essentieel zijn voor een goede ontwikkeling.

Protocol

Voorbereiden Hechting Chambers (de dag vóór de injectie / dissectie) Hechting Assay Chambers Als u een conventionele samengestelde microscoop (optische lokaliseert boven het podium), is het ncecessary om een ​​lage hoogte hechting kamer als volgt. Bij gebruik van de omgekeerde-optiek microscoop, dan "NUNC Lab-Tek Chambered dekglaasje" kan gewoon worden gebruikt, en sla de stappen # 1 – 2. Bevestig een van de "pers-to-seal silicium iso…

Materials

Material Name	Typ	Company	Catalogue Number	Comment
1x MBS-H	Buffer			Modified Barth’s medium: 1L recipe 5.14g NaCl 75mg KCl 0.2g NaHCO3 0.2g MgSO4•7H2O 60mg CaCl2•2H2O 80mg Ca(NO3)2•4H2O 2.38g HEPES, free-acid Adjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
CMF-MBS	Buffer			This is Ca2+/Mg2+-free version of MBS-H. 500ml recipe : 2.57g NaCl 37.5mg KCl 0.1g NaHCO3 1.19g HEPES, free-acid Adjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
1% agarose/1x Barth’s plates				as many as the number of samples
1% agarose/CMF-MBS plates				as many as the number of samples
E-Cadherin/Fc chimera	Reagent	Sigma	E-2278	Dissolve 0.1mg of solid E-cadherin in 100ul of 1x MBS-H containing 40% glycerol to make 100x master stock (1.0mg/ml). Store it in –20C. Make 1/100 dilution with 1x MBS-H to make 10ug/ml working solution just before you use. You need 200ul per samples of this working solution.
Fibronectin, 0.1% solution	Reagent	Sigma	F-1141	This pre-made solution can be used as 50x stock. Make 1/50 dilution with 1x MBS-H make 20ug/ml working solution just before you use. You need 200ul per samples of this working solution. I do NOT recommend using solid Fibronectin, because it is difficult to dissolve at 0.1% concentration to make the stock solution. Although it is more expensive, this pre-made 0.1% solution is better to obtain consistent results.
4% BSA /MBS-H	Buffer			BSA: molecular biology grade fraction V
Sigmacoted yellow tips	Tool
No.1 cover slips				40x24mm or 60x24mm
Press-to-seal silicon insulator	Tool	Glace Bio-Labs	JTR20-2.5	2.5mm depth x 20mm diameter
NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass	Tool	Fisher	12-565-471	2wells/slides
Grid slide glass	Tool			or Finder graticule for cell counting